Молекулярно-генетические методы находят все большее применение при проведении генетического анализа и генотипирования самых разных объектов [1]. Точные методы оценки генетического разнообразия в популяциях сельскохозяйствзнных животных, в частности коз, необходимы для планирования работ по разведению как промышленных, так и генофондных пород [2]. Использование ДНК-маркеров позволяет вовремя установить снижение генетического разнообразия и потерю ценных аллелей, которые могут оказаться востребованными в будущем при разведении животных [3]. В малочисленных генофондных популяциях помимо утери ценных аллелей, сужение разнообразия может привести и к ухудшению воспроизводительных качеств животных, что еще больше обостряет проблему сохранения этих популяций. В настоящее время существует несколько маркерных систем, позволяющих проводить молекулярно-генетический анализ состояния популяций животных. К числу наиболее широко используемых методов относятся методы, основанные на исследовании полиморфизма мини и -микросателлитной ДНК [4; 5]. Использование этих методов позволило подтвердить географическое происхождение пород коз. В частности, было установлено, что 41% генетических различий между породами коз обусловлено их местом происхождения [2]. Имеются данные, указывающие на малый обмен генетического материала между географически изолированными популяциями коз [6]. В целом, многие авторы отмечают невысокий уровень генетических различий между разными породами коз [2; 7].
Цель наших исследований заключалась в подтверждении генетической близости четырех пород коз и сравнении двух популяций одной породы, разводимых продолжительное время в разных странах.
Методика
В качестве молекулярного маркера использовали меченый дезоксигенином олигонуклеотид (ГТГ)5. ДНК выделяли из крови коз фенольно-детергентным способом. Объектом исследования служили образцы ДНК, выделенной из крови 75 коз 4 пород: Тогенбургер, Белая немецкая, Бурая немецкая и Тюрингская лесная. Последняя относится к числу малочисленных генофондных пород и включена в немецкий национальный реестр генофондных пород в соответствии с европейской программой сохранения биоразнообразия (Council Regulation – ЕЕС No 2078/92). Тогенбургеры представлены немецкой популяцией и популяцией из Швейцарии. ДНК расщепляли рестриктазой НаеШ, полученные фрагменты ДНК разделяли по размеру в агарозном геле, а затем переносили на нейлоновый фильтр. В ходе реакции молекулярной гибридизации меченый олигонуклеотид избирательно связывался с некоторыми фрагментами ДНК. Данные места на фильтре становились видимыми в виде полос (фрагменты ДНК) после проведения иммунохимической реакции с использованием цветных красителей. Методические детали были изложены ранее [4; 5]. Каждое животное характеризуется определенным набором полос (ДНК-фингерпринт) и отличается от других особей. Подсчитывается частота встречаемости одного и того же фрагмента у разных особей внутри популяции и между популяциями. Анализ проводился с использованием компьютерной программы RFLPscan, которая позволяет объективно определить положение фрагментов ДНК у каждого животного. Расчеты частот встречаемости фрагментов ДНК и другие популяционно-генетические параметры рассчитывали с использованием программы Gelstats [8]. Данная программа рассчитывает значительное число популяционно-генетических параметров, таких как частоты аллелей, коэффициенты сходства в популяциях животных и между популяциями, значения средней гетерозиготности по всем выявляемым фрагментам ДНК, подразделенность популяции на субпопуляции и т.д. Используя значения коэффициентов сходства, рассчитывали индекс различия между популяциями.
Результаты
Интересной особенностью полученных фингерпринтов у коз, в отличие от всех ранее изученных нами видов животных, было наличие очень интенсивно проявляющегося фрагмента ДНК у всех особей в районе длин фрагментов 8400 пар оснований ДНК. Помимо этого мономорфного фрагмента имелось еще несколько фрагментов ДНК‚ которые встречались с высокой частотой, доходящей до значений 0,9. Эти фрагменты оказали существенное влияние на конечные результаты при расчете популяционно-генетических параметров. Например, коэффициенты сходства (КС) внутри пород (таблица 1) оказались довольно высокими (при сравнении с данными для других видов животных).
Сравнение пород проводили попарно на отдельных фильтрах. Это необходимо для нивелирования различной интенсивности проявления фрагментов ДНК в отдельных экспериментах. Поэтому значения КС для одной и той же породы (популяции) на разных фильтрах могут несколько отличаться (таблица 1). Генофондная порода Тюрингская лесная во многих случаях при попарном сравнении с другими породами показывала повышенные значения КС, что говорит о сужении генетического разнообразия в этой породе (значения КС варьировали на разных фильтрах от 0,48 до 0,58). Особняком стояла популяция Тоггенбургеров, которая содержится изолированно на протяжении длительного времени в Швейцарии. В этой популяции коэффициент сходства был выше и достигал значений 0,61 (таблица 1). Длительное разведение в «себе» популяции швейцарских Тоггенбургеров привело к накоплению генетических различий с намецкими Тоггенбургерами. Тюрингская лесная порода характеризовалась пониженными значениями КС при сравнении с другими породами, что свидетельствует об определенном генетическом удалении данной породы от остальных пород. Генетически наиболее близкими явялются Белая и Бурая немецкие породы коз с индексом различия всего 0,005 (таблица 1).
Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры в популяциях коз четырех пород
| породы | Число особей | Число фрагментов ДНК | КС внутри
популяции |
КС между
популяциями |
Индекс различия |
| ТЛ
БуН |
15
15 |
8,07±1,10
7,13±2,44 |
0,48*
0,42* |
0,37 | 0,08 |
| ТЛ
ТГ |
15
15 |
7,60±0,99
9,93±2,76 |
0,58*
0,47 |
0,46 | 0,07 |
| ТГ
ТГшв |
20
10 |
11,35±2,32
11,70±1,95 |
0,48
0,61* |
0,48 | 0,07 |
| БН
ТЛ |
15
15 |
8,60±1,96
7,13±1,73 |
0,48*
0,56* |
0,44 | 0,08 |
| БН
БуН |
15
15 |
8,73±1,67
8,27±2,05 |
0,48
0,45 |
0,46 | 0,005 |
ТЛ – Тюрингская лесная, ТГ – Тоггенбургер, ТГшв – Тоггенбургер, популяция из Швейцарии, БН – Белая немецкая, БуН – Бурая немецкая. КС – коэффициент сходства. * Р<0,05 (сравнение КС внутри и между популяциями).
Прямым подтверждением сужения генетического разнообразия в швейцарской популяции Тоггенбургеров и генофондной породы Тюрингская лесная являются относительно низкие значения гетерозиготности – 0,40 и 0,46, соответственно (таблица 2). Данный показатель у Бурой немецкой породы достигал значения 0,59. Несмотря на то, что в швейцарской популяции Тоггенбургеров выявляется наибольшее число локусов – 8,36, гетерозиготность находится на низком уровне, так как отмечается малое число аллелей на один локус – 3,23 (таблица 2).
Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость изученных пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.
Таблица 2 – Внутрипопуляционный генетические параметры в популяциях коз
|
порода |
число локусов |
Число аллелей/локус |
Р* |
гетерозиготность |
|
ТГ |
6,99 |
5,38 |
4,44×10-4 |
0,53 |
|
ТГшв |
8,36 |
3,23 |
3,23×10-3 |
0,40 |
|
БН |
5,61 |
5,79 |
1,78×10-4 |
0,55 |
|
БуН |
4,85 |
6,95 |
1,60×10-3 |
0,59 |
|
ТЛ |
5,17 |
4,59 |
1,87×10-2 |
0,47 |
*P – вероятность того, что две особи из популции будут иметь одинаковое распределение фрагментов ДНК на фильтре.
Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.
Библиографический список
- Terletski V. P., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Subtracted restriction fingerprinting – a tool for bacterial genome typing // BioTechniques. 2003. V.34. P. 304-313.
- Canon J., Garcia D., Garcia-Atance M.A. Geographical partitioning of goat diversity in Europe and the Middle East // Animal Genetics. 2006. V.37. No.4. P.327-334.
- Киселева Т.Ю., Подоба Б.Е., Заблудовский Е.Е., Терлецкий В.П., Воробьев Н.И., Kantanen J. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота. // Сельскохозяйственная биология. 2010. №6. С.20-25.
- Митрофанова О.В., Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Исследование особенностей генетической гетерогенности пород и экспериментальных популяций кур на основе анализа полиморфизма ДНК // Доклады РАСХН. 2007. №6. С.36-38
- Тыщенко В.И., Митрофанова О.В., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Оценка генетического разнообразия в породах и экспериментальных популяциях кур с помощью ДНК-фингерпринтинга // Сельскохозяйственная биология. 2007. №4. С.29-33.
- Agha S.H., Pilla F., Galal S. Genetic diversity in Egyptian and Italian goat breeds measured with microsatellite polymorphism // Journal of Animal Breeding and Genetics. 2008. V.125. No.3. P.194-200.
- Saitbekova N., Gaillard C., Obexer-Ruff G. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis // Animal Genetics. 1999. V.30. No.1. P.36-41.
- Rogstad S.H., Pelican S. GELSTATS: A Computer program for Population Genetics Analysis Using VNTR Multilocus Probe Data // Biotechniques. 1996. V.21. No.6. P.1128-1131.
Количество просмотров публикации: Please wait