Актуальность проблемы.  Способ и устройство   относится к микробиологии, предназначено для индикации, количественной и качественной оценке популяций микроорганизмов и может быть использовано для своевременного обнаружения возбудителей болезней в воздухе  закрытых помещений, при изыскании  лечебно-профилактических мер борьбы с бактериальными и вирусными респираторными болезнями.

Целью настоящей работы является научно- производственное испытание  разработанного способа и устройства для микробиологического анализа воздуха.

Известно много устройств, в которых осаждение бактериального аэрозоля осуществляется на чашки Петри с питательной средой. Они основаны на использовании инерции быстродвижущихся частиц. В процессе взятия пробы воздуха осуществляется посев микроорганизмов, которые в последующем культивируются и через 24-48 часов подсчитываются количество выросших колоний (чашечный импактор Андерсена, аппарат Кротова)[ 3,с.152].

Известен способ микробиологического исследования воздуха путём пропускания его через импактор с твёрдой питательной средой, содержащей тест-культуру. По этому способу воздух пропускают через импактор перед внесением в питательную среду тест-культуры, последнюю пропускают через импактор в виде полудисперстного аэрозоля концентрацию и состав антимикробных частиц определяют по числу зон отсутствия роста на твёрдой питательной среде (Авт. свидетельство № 639937 М. Кл³ С 12 I/00).

Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятые автором за эффективной технологией  является способы микробиологического анализа воздуха   (Авт. свидетельства №777061 М. Кл³ С 12 К I/00; № 968071 М.  Кл³ С 12 К I/00), которые заключаются в том, что  осуществляют осаждение микроорганизмов из воздуха  на поверхность твёрдой питательной среды, термостатирование осажденных микроорганизмов в течении суток и подсчёт выросших  колоний микроорганизмов. Эти способы выбраны за прототип. Названные способы для микробиологического анализа воздуха имеют один общий недостаток, касающийся точности. Результаты анализа не отличаются особой точностью в связи с тем, что посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды осуществляется в процессе взятия пробы воздуха. Определение концентрации клеток в образце, которое основывается на прямом подсчете колониеобразующих единиц, выросших на агаризованных средах может быть ошибочным ввиду того, что не все жизнеспособные микробные клетки в принципе могут образовывать колонии на твердой питательной среде, а также отсутствие роста может быть результатом их определенного физиологического и метаболического состояния [4,с.71-74].    При инкубировании не все бактериальные клетки, находящиеся на поверхности аэрозольных частиц, не контактируют полностью с питательной средой и остаются в «дремлющем» состоянии, не образуя колонии. У других, образование видимых колоний не происходит в связи с тем, что количество питательного раствора, способного диффундировать в клетки, расположенные на поверхности аэрозольных частиц, ограничено, а их запасы в непосредственной близости быстро истощаются. В результате определённая часть микроорганизмов остаётся не учтённой, что и влияет на результат анализа. Необходимо также иметь в виду, что в воздухе могут быть  некультивируемые микроорганизмы, которые не растут ни на каких питательных средах. Некультивируемые формы  (НФ) в настоящее время  описаны у многих микроорганизмов различной таксономической принадлежности [9,c. 34-37].

Находясь в некультивируемой форме, бактерии остаются жизнеспособными и сохраняют свой адаптивный, метаболический и эпизоотический потенциал. При определенных условиях некультивируемые формы бактерий восстанавливают свою способность к активному росту и размножению.  Состояние анабиоза, возможно в результате обезвоживания организмов (ангидробиоза).  Высушивание микроорганизмов до остаточной влажности 10% приводит к замедлению и полному прекращению метаболизма с переходом в состояние анабиоза. При  естественном ангидробиозе наблюдается глубокое и длительное торможение метаболизма, оно   достаточно распространенное в природе явление. В процессе  регидратации  создаются  благоприятные условия выхода микробной клетки из этого состояния. В результате структурной и функциональной перестройки клетки при ее переходе активизируются процессы роста и размножения,  происходит повышение адаптивного и метаболического потенциала. Торможение жизнедеятельности клеток [ 2, 239 с. ;5, 256 с.]. Кроме того,  воздушная среда представлена ассоциациями различных групп микроорганизмов, которые находятся в сложных взаимоотношениях обусловленных конкурентным использованием пищевых продуктов и других факторов среды обитания. При выращивании смешанных культур  процессы роста и размножения определяются составом питательной среды, концентрацией и доступностью химических составных частей среды, потребляемых  микроорганизмами различной таксономической принадлежности, температурой и реакцией среды, наличием в ней кислорода, влажностью. Не менее существенное значение может иметь наличие фагов, а также присутствие микроорганизмов продуцирующих бактерицидные, токсические,  литические,  или антогонистические вещества. В процессе культивирования в среде накапливаются продукты метаболизма, которые также влияют на процессы роста и размножения.

Материал и методы исследований. Существующие способы микробиологического анализа воздуха позволяют определять бактериальную флору и чаще всего выражаются колониеобразующими единицами (КОЕ в 1л воздуха). Что касается вирусов и бактериофагов,  которые могут находиться  на аэрозольных частицах, то они не учитываются, поскольку требуют особых условий культивирования. Это касается также спор микроскопических грибов – продуцентов ферментных препаратов, дрожжевых грибов, L – форм   и других физиологических групп микроорганизмов для которых требуются специальные методические приёмы и питательные среды.

Результаты исследований и обсуждение. Технический результат,  с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности способа микробиологического анализа воздуха и достигается тем, что  взятие пробы воздуха осуществляется в улавливатель микроорганизмов (Патент № 72406 МПК А61М1/00. Улавливатель микроорганизмов[6] содержит конусообразную ёмкость 1 с улавливающей жидкостью 2 и крышку 6, установленную в верхней части ёмкости, фильтр 4 и выполненное под острым углом к вертикальной оси ёмкости в её средней части отверстие 7 малого диаметра для поступления воздуха через осевой завихритель 9 штуцера 8. При отборе пробы в улавливатель микроорганизмов поступает вихревой поток воздуха с большой скоростью, однако за счёт понижения давления в конической ёмкости улавливателя, гидродинамической кавитации и перемешивания происходит диспергирование аэрозолей в жидкости.  После взятия  пробы воздуха и  кавитационной  дезинтеграции аэрозольных частиц в ёмкости с улавливающей жидкостью, осуществляют посев  улавливающей жидкости с микроорганизмами на поверхность  плотной питательной среды (преимущественно, в  мясо – пептонный агар-МПА), а после  культивирования в течение 24-48 часов  подсчитывают количество выросших колоний

Желаемый технический и технологический результат достигается с помощью устройства и способа микробиологического анализа воздуха. Сущность предлагаемого способа микробиологического анализа воздуха заключается в следующем: осуществляют взятие  пробы воздуха с помощью улавливателя микроорганизмов в улавливающую жидкость, в которой за счёт гидродинамической  кавитации происходит дезинтеграция аэрозольных частиц и осаждение их в улавливающую жидкость и далее посев улавливающей жидкости на поверхность плотной питательной среды, культивирование посевов в термостате в течение 24-48 часов при температуре 37,5 градусов,  с последующим подсчетом  видимых колонии микроорганизмов.

Повышение точности анализа достигается за счёт   гидродинамической кавитации  и дезинтеграции, аэрозольных частиц при взятии пробы воздуха. Аэрозольные конгломераты, в которых находятся микроорганизмы диспергируются на отдельные бактериальные или вирусные частицы. При осаждении, аэрозольных частиц и последующем высеве улавливающей жидкости на плотную питательную среду формируются отдельные хорошо видимые  колонии. Чтобы расти и размножаться микроорганизмы должны получать из питательного субстрата все вещества, которые необходимы им для синтеза структурных компонентов клетки и для получения энергии. В результате высева улавливающей жидкости  с плотной средой создаётся необходимый контакт клеточной стенки микроорганизмов с питательным субстратом, что индуцирует рост, начало клеточного деления, размножение и образование колоний.

Важным фактором, способствующим росту, размножению и образованию колоний микроорганизмов является плотность питательного субстрата. Плотность в данном случае следует понимать как свойство агара, определяющее её прочность (упругость) и зависимость от концентрации. Известно, что при высокой прочности агара получается скудный рост микроорганизмов, некоторые из них не могут формировать видимых колоний. Среда с низкой прочностью студня наоборот способствует росту не характерных, расплывчатых колоний. Плотность питательного субстрата не только механически препятствует формированию различных колоний, но и влияет на процессы диффузии питательных веществ и продуктов обмена микроорганизмов.

Повышение концентрации агара увеличивает количество столкновений частиц при броуновском движении, что способствует и ускоряет застудневание, а скорость диффузии находится в обратной зависимости от концентрации студня. Чем выше концентрация, тем меньше скорость диффузии. Объясняется это тем, что в концентрированном геле резко возрастает извилистость пути, который должна совершать диффундирующая частица. Кроме того, диффузия в плотной питательной среде отличается от таковой в жидкой среде тем, что здесь отсутствует перемешивание и невозможно образование конвекционных потоков, возникающих в жидких питательных средах.

Так как рост колоний лимитируется скоростью диффузии продуктов обмена, посев улавливающей жидкости способствует улучшению процессов питания и удалению (диффузии) продуктов обмена в процессе роста, размножения и формирования колоний.

В результате сравнительного испытания различных способов микробиологического анализа воздуха было установлено (см. таблица 1), что степень бактериальной обсеменённости,  его по предлагаемому способу выше, чем по известному.

Предлагаемое устройство и способ по сравнению с другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

--  взятие пробы воздуха  и осаждение аэрозольных частиц осуществляется в жидкость улавливателя микроорганизмов, где происходит их регидратация;

-  воздушная среда представлена  различными фракционно- дисперсными   аэрозольными    частицами, а    в процессе отбора проб воздуха происходит   дезинтеграция частиц, которые нагружены микроорганизмами,  непосредственно в улавливающей жидкости конической ёмкости улавливателя ;

- посев улавливающей жидкости на плотную питательную среду обеспечивает более благоприятные условия для роста микроорганизмов, клеточного деления и формирования видимых колоний;

- обеспечивает рост микроорганизмов находящихся в «дремлющем состоянии;

-  не требует дополнительных затрат и обучения персонала;

- позволяет осуществлять непрерывный мониторинг воздушной среды в условиях возможных техногенных, природных и террористических угроз и своевременно обеспечивать защиту животных и обслуживающий персонал на предприятиях по производству, и переработке животноводческой продукции, в торговых и центрах  общественного питания и предприятиях биологической промышленности;

- в устройстве происходит отделения микроорганизмов от газовой фазы и  используются различные механизмы улавливания микроорганизмов, (седиментационные, сорбционные, фильтрационные), что  позволяет в дальнейшем (после отбора пробы воздуха) использовать различные варианты микробиологического анализа биологического аэрозоля. Поскольку воздушная среда животноводческих и закрытых производственных помещений представлены с  различными физиологическими группами микроорганизмов возможно дифференцированное определение численности бактерий путем высева образцов смешанных культур  не только на плотные, но и на жидкие селективные питательные среды. Применение селективных сред, предназначенных для роста клеток одной определенной таксономической группы, позволяет осуществлять культивирование и дифференциацию целевых видов бактерий.

Сравнительная эффективность различных способов микробиологического анализа воздуха и  с использованием различных устройств, представлена  в табл.1

Таблица  1. Сравнительная эффективность различных способов микробиологического анализа воздуха

Заключение. Способ и устройство для  микробиологического анализа воздуха, включающий осаждение аэрозольных частиц и посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды, последующее термостатирование проб и подсчет числа колоний, выросших на поверхности среды,  отличающийся тем, что   осаждения аэрозольных частиц осуществляется в жидкость улавливателя микроорганизмов, с последующей дезинтеграцией и регидратацией аэрозольных частиц,  а посев  суспензии  микроорганизмов  проводится на плотную питательную среду.

1. Дмитриев А.Ф., Морозов В.Ю.. Устройство для концентрации микробиоты воздуха закрытых помещений// научное приборостроение, 2008, том 18, № 2, c. 98–103
2. Бекер М.Е., Рапопорт А.И.,  Калакуцкий Л.В. и др. ; Под общ. ред. М. Е. Бекера; АН ЛатвССР, Ин-т микробиологии им. Августа Кирхенштейна.- Рига Зинатне 1987. – 239 с.
3. Влодавец В.В. «Основы аэробиологии.-  М.: Медицина, 1972. -152 с
4. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию. Москва, 2001, с.71-74
5. Тимофеев Н.Н. “Гипобиоз и криобиоз». Настоящее, прошлое и будущее.” М.:”Информ-Знание”, 2005- 256 с.
6. Патент № 72406 МПК А61М1/00. Улавливатель микроорганизмов /Дмитриев А.Ф., Морозов В.Ю.// – заявка № 2007141943/22 от 12.11.2007; опубл.20.04.2008. Бюл. № 11
7. Флеров Ю.Л., Андреев Е.Ф. ,Сафиулин А.А. (56) Авторское свидетельство СССР У 639937, кл. С 12 М 100,  устройство для микробиологического анализа воздуха. Бюл.№20.1977.4с
8. Флеров Ю.Л., Хрустов П.Е., Сафиуллин А.А. и др. Способ микробиологического исследования воздуха и устройство для его осуществления. А.с. 777061 СССР. Бюл. № 41. 1980. 6 с
9. Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Молекулярная генетика 1993. – № 6. – С. 34-37.

Все статьи автора «Ахмадиев Габдулахат Маликович»