Введение. Экологически чистым методом контроля над фитопатогенами является биологический метод, предполагающий использование штаммов-антагонистов. Одним из наиболее широко используемых видов микроорганизмов-антагонистов фитопатогенных бактерий и грибов является сенная палочка – B. subtilis [1, P. 32]. Это объясняется биологическими свойствами данного вида, такими как распространенностью в природе и, следовательно, приспособляемостью к различным условиям среды, в том числе с помощью угнетения других видов конкурентных микроорганизмов. Кроме того, сенная палочка образует споры, что позволяет получать биопрепараты достаточно стабильные при хранении. Для надежной идентификации и паспортизации таких штаммов необходимо применение современных методик генотипирования микроорганизмов. Генотипирование позволяет присвоить молекулярно-генетический «штрих-код» каждому штамму, что крайне важно при использовании штаммов на практике, при решении спорных вопросов  и  при хранении коллекций штаммов в лабораторных условиях. Помимо этого, есть вероятность того, что определенный фрагмент ДНК может быть сцеплен с важной биологической или хозяйственно-полезной особенностью штамма, что позволит использовать его в качестве маркера данного свойства при изучении других потенциально полезных штаммов.

Существует множество методов типирования микроорганизмов. В настоящее время однозначно доказано, что методы, основанные на полиморфизме геномной ДНК (генотипирование), являются наиболее чувствительными  и воспроизводимыми [2, P. 4; 3, P. 136].

На сегодня самым точным методом генотипирования является метод ДРИМ (двойное расщепление и избирательное мечение), который впервые был разработан для клинических изолятов патогенных микроорганизмов – Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Salmonella spp. [4, P. 284; 5, P. 417]. Результатом генотипирования методом ДРИМ является группа фрагментов ДНК в виде полос на фильтре, распределение которых специфично для каждого штамма или близкородственной группы штаммов. Точность идентификации штаммов, рассчитываемая по индексу дискриминации [6, P. 2465] превышает точность текущего «золотого стандарта» генотипирования (пульс-гель электрофорез) и достигает для отдельных видов микроорганизмов значения 0,98.

Методика. Генотипирование микроорганизмов предполагает  выделение высокомолекулярной геномной ДНК. На первом этапе исследований была предложена надежная и быстрая методика выделения геномной ДНК из сенной палочки. Для этого микроорганизм культивируют в среде с целью получения чистой культуры. Было исследовано ряд подходов к выделению ДНК и метод, основанный на использовании лизоцима для разрушения клеточной стенки, оказался наиболее эффективным.

В ходе работы была выбрана наиболее простая и технологичная методика выделения высокомолекулярной геномной ДНК B. subtilis. Все этапы этой оптимальной процедуры изложены ниже:

центрифугировать  культуральную среду и собрать надосадочную жидкость. Осадок культуральной можно среды выбросить;

культивировать  B. subtilis в этой прозрачной среде при 30ºС в течение ночи (примерно 16 часов), аэробно, на шейкере 200 об/мин;

центрифугировать 3 мл культуры 8000 об/мин 5 минут, слить надосадочную жидкость;

суспендировать осадок бактерий в 300µl буфера TES (50 mMTris-HCL -20 mMEDTA – 10mM NaCL, 8,0), внести 30µl лизоцима (10 мг/мл, буфер ТЕ -10 мМтрис-1мм ЭДТА), смешать, инкубировать при  37ºС 60 минут;

внести 20 µl SDS (10% в воде), смешать, инкубировать при  37ºС 15 минут;

внести равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, мешать 3 минуты, центрифугировать 10000 об/мин 10 минут;

отобрать верхнюю фазу в другую пробирку;

прибавить равный объем изопропилового спирта, смешать;

центрифугировать, осадок ДНК промыть 70% этиловым спиртом, подсушить и растворить в 50µl буфера ТЕ.

Следующим этапом генотипирования B. subtilis является расщепление полученной ДНК двумя ферментами рестрикции с одновременным мечением биотином. Используется две рестриктазы – крупнощепящая и мелкощепящая. Поиск in-silico выявил, что лучшей крупнощепящей рестриктазой является SgsI, имеющий сайт узнавания и расщепления GG↓CGCGCC. Данный фермент имеет 39 сайтов расщепления в геноме B. subtilis и производит «липкие» концы, которые метятся биотинилированным дезоксицитозином (Bio-dCTP) с помощью Taq-полимеразы. Получаемые фрагменты ДНК не могут быть разделены в обычном агарозном геле, так как являются слишком крупными. Поэтому, в реакцию вводим мелкощепящую рестриктазу. В результате такого двойного расщепления размер фрагментов ДНК является оптимальным для разделения в агарозном геле. Особенностью мелкощепящей рестриктазы является то, что получаемые фрагменты ДНК имеют либо тупые, либо 3¢-выступающие концы, которые не могут включить Bio-dCTP. Таким образом, в реакционной смеси присутствует ограниченное число меченых фрагментов ДНК, которые могут быть разделены и визуализированы.

Методически процедура генотипирования ДРИМ включает 1) двойное расщепление и избирательное мечение 2) электрофорез в агарозном геле 3) перенос фрагментов ДНК на нейлоновый фильтр 4) детекцию фрагментов ДНК на фильтре.

Двойное расщепление и избирательное мечение сводится к внесению в микропробирку 15 мкл воды, 2 мкл 10-кратного буфера R (Fermentas™), 2 мкл выделенной геномной ДНК и 1 мкл ферментной смеси (две рестриктазы, Taq-полимераза и метка Bio-dCTP). Инкубация проводится в течение 2-3 часов при 37°С.

Электрофорез происходит в 0,8% агарозном геле длиной20 смпри напряжении 60В в течение 16 часов.

Перенос разделенных в электрофорезе фрагментов ДНК на нейлоновый фильтр осуществляется немедленно после электрофореза в дистиллированной воде на вакуумном приборе (денатурация и нейтрализация ДНК не требуется). Детекция фрагментов ДНК на фильтре проводится с помощью обычной цветной химической реакции, основанной на выявлении щелочной фосфатазы.

Результаты. После испытания группы рестриктаз была определена оптимальная комбинация для последующего использования в генетической паспортизации штаммов B. subtilis – SgsI и Eco32I. Рестриктаза SgsI имеет 39 сайтов расщепления в геноме B. subtilis (теоретически максимальное число фрагментов ДНК будет 78). Получаемые фрагменты ДНК могут быть помечены биотином в реакции ДРИМ. Рестриктаза Eco32I имеет 1684 сайта расщепления, что дает средний размер фрагмента ДНК сенной палочки 3000 пар оснований, что является оптимальным с точки зрения разделения ДНК в 0,8% агарозном геле. Указанные рестриктазы хорошо совместимы в одном буфере – буфер R (Fermentas™), не проявляют «звездной» активности, стабильны, достаточно специфичны и не дороги.

Генотипирование позволяет выявить более 30 фрагментов ДНК, распределение которых специфично в отношении каждого штамма. После оптимизации условий проведения реакции ДРИМ на двух штаммах сенной палочки, было проведено генотипирование 13 штаммов.

В результате было выявлено 6 групп (кластеров) генотипически идентичных штаммов:

1)    В10

2)   М22, 1И, 2И, 3И, 4И, 5И

3)   1К

4)   ФР-318

5)   ФР-327

6)   147/48/314, 110/723, 85/3/8 (Longus niger)

Метод ДРИМ позволил идентифицировать следующие уникальные штаммы – 1К, ФР-318, и ФР-327. В то же время, имеются три группы штаммов, которые не были дифференцированы на отдельные генотипы – это группы 2 и 6 в списке. Возможным объяснением этого может быть генетическая близость указанных штаммов в пределах каждой группы. При накоплении определенного числа мутационных изменений в геноме появляются изменения и в распределении фрагментов ДНК (например, штаммы ФР-318 и ФР-327 отличаются всего двумя фрагментами ДНК). При появлении любых несовпадений в распределении фрагментов ДНК у двух изучаемых образцов можно на 100% утверждать, что образцы относятся к двум генетически различным микробным штаммам. С другой стороны, если два образца не различаются, есть некоторая вероятность, что они все-таки различны. Не исключено, что другие методы анализа могут в каких-то случаях выявить разницу. Однако, данные на нескольких видах клинически значимых микроорганизмов (сальмонеллы, золотистый стафилококк, псевдомона и клостридии) указывают, что метод ДРИМ самый высокочувствительный в плане выявления генетических различий между штаммами.

Таким образом, метод позволяет идентифицировать отдельные штаммы и группы близкородственных штаммов сенной палочки. Метод можно рекомендовать для контроля идентичности антифитопатогенных биопрепаратов бактериальной природы при их коммерческом производстве. При промышленном производстве биопрепаратов маловероятна контаминация другим коммерческим или генетически близким штаммом. Скорее всего, контаминация происходит каким-либо диким природным штаммом, который генетически значительно отличается от коммерческого и, следовательно, может быть идентифицирован методом ДРИМ.

Заключение.        Был разработан эффективный метод выделения высокомолекулярной геномной ДНК B. subtilis, оптимизированы условия проведения молекулярно-генетического типирования для идентификации и паспортизации бактериальных штаммов.

1. El-Hamshary O.I.M., Abo-Aba S.E.M., Awad N., Gomaa A.M. Genetic profile of Bacillus subtilis indigenous isolates and their performance as Bio-control agent against the plant pathogen Fusarium oxysporum // Res.J.Cell Mol.Biology. 2008. V. 2. P.30-38.
2. Van Belkum. Guidelines for the validation and application of typing methods for the use in bacterial epidemiology // Clin. Microbial. Infect. 2007. V. 13. P. 1-46.
3. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF) // Microbiol. Res. 2003. V.158. P. 135-142.
4. Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates // J. Microbiol. Methods. 2008. V. 72. P. 283-287.
5. Terletskiy V., Tyshchenko V.,Martinez-BallesterosI.et al.Validation of Double Digest Selective Label database for sequenced prokaryotic genomes // Bioinformatics. 2010. V. 26. P. 417-418.
6. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity // J. Clin. Microbial. 1988. V. 26. P. 2465-2466.

Все статьи автора «Терлецкий Валерий Павлович»