В настоящее время пересадка, как ранних эмбрионов, так и морул-бластоцист  широко применяется в животноводстве [1]. Именно трансплантация позволяет полнее использовать,  и увеличивать важные и ценные генотипы выдающихся животных по продуктивным качествам, особей, устойчивых к разным заболеваниям или редких, вымирающих индивидуумов. Одним из хорошо изученных и удобных объектов для экспериментов служит кролик [2]. Трансплантация является также важным и промежуточным звеном в разработках инновационных клеточных технологий, таких как получение трансгенных и клонированных животных [3,4].  Как известно, различают ауто-, гомо- и гетеротрансплантацию.  Для получения трансгенных животных аутотрансплантации используется в крайне редких случаях, т.к. этот вид трансплантация хуже переносится животными имеет методические сложности, не всегда приводит к рождению потомства. Самым распространенным видом трансплантации в технологии получения генетически модифицированных животных является гомотрансплантация, когда донором и реципиентом служат разные самки одной породы. Первые успешные попытки трансплантации эмбрионов кроликов были проведены еще в конце девятнадцатого века и в первой декаде двадцатого столетия. Следует отметить, что в этом случае необходимо подготовить самку-реципиента и вызвать у нее ложную беременность либо за свет введения хорионического гонадотропина, либо при спаривании с вазектомированном самцом. Как правило, в случае пересадки эмбрионов разных пород применяют гетеротрансплантацию. Если животные отличаются по фенотипическим признакам (например, по окраске), то самку-реципиента удобнее спаривать с плодовитым самцом, что повышает количество и количество полученных эмбрионов. Целью настоящего исследования явилось проведение анализа качества эмбрионов и эффективности получения трансплантированных эмбрионов у кроликов.

Материал и методы исследований. Работа проводилась на молодых кроликах в возрасте до года, причем использовали животных разных пород, таких как  белый великан, шиншилла и  новозеландская. К 4-5 месяцам кролики достигают половой зрелости. Продолжительность беременности составляет 27-32 дня. У крольчих, в отличие от других животных, яйцеклетки выходят из яичников только после покрытия ее самцом. В этот период времени в кровь самки поступают гонадоторопные гормоны гипофиза, под влиянием которых происходит дозревание, разрыв фолликулов и овуляция яйцеклеток.  Через 10-12 часов после спаривания наступает овуляция.  У кроликов оплодотворение яйцеклеток наступает в ампуле яйцевода. Животные находились в стандартных условиях кормления и содержания [5]. Для получения в качестве реципиентов псевдобеременных самок с датированным сроком беременности удобно использовать вазектомированных самцов. С этой целью операционный бокс стерилизовали ультрафиолетовым излучением. У животных выбривали операционное поле, обрабатывали 5% раствором йода проводили местную анастезию вдоль будущего разреза.  В месте изгиба обоих семяпроводов отпрепарировали проходящие рядом кровеносные сосуды,  перевязывали семяпроводы тонким шелком в двух местах и их перерезали. Брюшину зашивали кетгутом матрасным швом, кожу и подкожную клетчатку зашивали шелком. С целью получения зигот самок спаривали на стадии эструса. Для извлечения большого количества предимплантационных эмбрионов была проведена суперовуляция за счет введения гонадотропина PMSG (гонадотропин сыворотки жеребой кобылы)  и гормона hCG (человеческий хорионический гонадотропин). Далее животным давали общий наркоз и проводили лапоротомию  со вскрытием брюшной полости. Операцию осуществляли путем рассечения вначале кожи, подкожной клетчатки, белой линии апоневроза живота и наконец, пристеночной брюшины. По наличию желтых тел в яичниках определяли количество зародышей в яйцеводах, которые затем промывали  буфером PBS с добавлением 5%-го раствора фетальной сыворотки.  По окончании операции брюшину зашивали кетгутом, кожу – шелковой нитью. Полученные ранние эмбрионы трансплантировали псевдобеременным самкам, которые предварительно были спарены с вазектомированным самцом или реципиентов обрабатывали гормонально. Трансплантацию проводили операционным путем с учетом желтых тел. Животным внутримышечно вводили антибиотики.

Результаты исследований и обсуждение. Учитывая, что спаривание у этих животных провоцирует овуляцию можно точно определить сроки беременности, а в случае ложной беременности удобно получать синхронизацию сроков беременности при гомотрансплантации ранних эмбрионов.  В технологии трансгенеза первым и важным этапом является получение ранних эмбрионов (зиготы, двухбластомерные эмбрионы) хорошего качества. В этот период необходимо провести морфологическую оценку эмбрионов с целью выбраковки аномальных форм развития, таких как неоплодотворенные яйцеклетки, эмбрионы с фрагментацией цитоплазмы, с увеличенным перивителлиновым пространством, с видимыми геномными нарушениями (рис. 1). Применение оптики дифференцианального интерференционного контраста по Номарскому позволило выявить эмбрионы с триплоидным и тетраплоидным набором хромосом.

На первом этапе была проведена гетеротрансплантация. Донором была оплодотворенная самка породы шиншилла, от которой операционным путем было получено   6 зигот хорошего качества. Реципиентом служила оплодотворенная самка белый великан, от которой получили 7 зигот. Этой самке было пересажено 4 эмбриона породы шиншилла и 4 эмбриона от белого великана (с учетом желтых тел).  После окрола было получено потомство в виде двух серых крольчат (порода шиншилла) и двух белых (порода белый великан). Таким образом, эффективность гетеротрансплантации составила 50%. В дальнейшем была использована только гомотрансплантация, причем в качестве доноров выступали две группы животных: крольчихи которым проводили суперовуляцию и самки после обычного спаривания. Как показали дальнейшие исследования гормональная суперовуляция позволяет получать большое количество ранних эмбрионов (более 30), однако, среди эмбрионов встречается большое количество неоплодотворенных яйцеклеток и морфологически аномальные эмбрионы. Кроме того, не у каждой крольчихи гормональная стимуляция вызывала эффект суперовуляции, тогда как  такие явления у эмбрионов, полученных после обычного спаривания с половозрелых самцов, наблюдались в незначительной степени (табл.1).

Таблица 1. Оценка донорских ранних эмбрионов кроликов

В среднем в первой группе животных получено 8,3 эмбриона на самку, а во второй группе (после суперовуляции) – 19,8.  Проведенный       морфологический анализ зигот и 2-х бластомерных эмбрионов показал, что в первой группе наблюдали только 3% аномальных эмбрионов, из которых одна яйцеклетка была не оплодотворена, у двух зигот наблюдали  увеличенное перивителлиновое пространство и у одного эмбриона фрагментация цитоплазмы. Все остальные эмбрионы были хорошего качества.  Анализ эмбрионов кроликов, полученных после суперовуляции, показал другую картину. Более половины из аномальных яйцеклеток оказались неоплодотворенными (55,5%). Три эмбриона были триплоидные, два – тетраплоидные, остальные имели фрагментацию цитоплазмы. Эти результаты убеждают в необходимости тщательного анализа эмбрионов перед трансплантацией.

После детального анализа ранних эмбрионов проводили трансплантацию донорских эмбрионов. При выборе места пересадки учитывали стадию развития эмбрионов и подсчитывали количество желтых тел в яичниках реципиентов. Зиготы и двухбластомерные эмбрионы вводили в ампульную часто яйцевода.  Важным моментом является гормональная синхронизация доноров и реципиентов, т.к. только в этом случае после трансплантации можно получить потомство. В таблице 2 представлены результаты пересадки эмбрионов реципиентам.

Таблица 2. Результаты гомотрансплантации ранних эмбрионов кроликов реципинтам

Таким образом, эффективность трансплантации в группе эмбрионов, полученных после спаривания с самцом, оказалась выше, чем пересадка эмбрионов, полученных после гормональной стимуляции доноров.  В первом случае в среднем одному реципиенту было пересажено  10,7 эмбриона, а во втором – 14,1. Возможно, эти различия могут быть связаны как с качеством эмбрионов, так и с разбалансировкой гормонального статуса доноров и реципиентов. Следует отметить, что после микроинъекции генов в ранние эмбрионы (для получения трансгенных особей), эффективность трансплантации падает до 9-15%, при этом наряду с живыми крольчатами рождаются мертворожденные [3]. Довольно часто используют репортерные гены для селекции эмбрионов [6], что повышает эффективность трансплантации и процесса трансгенеза. Следует также учитывать, что экспрессия репортерных генов  не нарушает развитие клеток и их физиологию. Тем не менее, довольно часто можно наблюдать мозаицизм интеграции и экспрессии трансгенов, когда не во всех клетках организма интегрированы трансгены [7]. В настоящее время прогресс в области соматического клонирования, основанного за счет пересадки ядер, позволяет получать модифицированные геномы без эффекта мозаицизма [8].  Кролики издавна используются как биомедицинские модели для изучения репродуктивных нарушений, процессов оплодотворения, органогенеза и многих других заболеваний у человека [9].     В дальнейшем представленная методика получения ранних эмбрионов  была использована в наших исследования для получения трансгенных кроликов [3].

1. Никиткина Е.В., Пестунович Е.М. Егиазарян А.В. Актуальность трансплантации эмбрионов. // Сельскохозяйственные вести. 2011. №2. С.2-3.
2. The Biology of the Laboratory Rabbit. Ed.by S.H. Weisbroth, R.E. Flatt, A.L. Kraus. Acad. Press. INC. New York, San Francisco. 1974.
3. Козикова Л.В. Трансгенные животные. СПб.: Проспект Науки. 2017.
4. Li F., Li Y., Liu H., Zhang H., Liu C., Zhang X.,Dou H., Yang W., Du Y. Production of GHR double-allelic knockout Bama pig by TALENs and handmade cloning. //Yi Chuan. 2014. V.36. №9. P.903-911.
5. Сысоев В.С., Александров В.Н. Кролиководство. М. 1975.Агропромиздат.
6. Duszewska A.M., Cybulska M., Korwin-Kossakowski M., Was B., Poloszynowicz J., Wicinska K., Rosochacki S.J., Kozikova L. The use of green fluorescent protein (GFP) to select bovin embryos. // J. of Animal and Feed Sciences 2003.   T.12. №1. C.71-81.
7. Makarova IV, Kazakov AA, Makarova AV, Khaidarova NV, Kozikova LV, Nenasheva V.V., Gening L.V., Tarantul V., Andreeva L.E. Transient expression and activity of human DNA polymerase iota in loach embryos. //Biotechnol Lett. 2012. V.34.  №2. Р. 205-12.
8. Xiujing Feng, Shaoxian Cao, Huili Wang., Chunhua Meng, Jingxin Li et al. .  Production   of Transgenic dairy goat expressing human a-lactolbumin by somatic cell nuclear transfer. //Transgenic Res. 2015. V.24. P. 365-372.
9. Bernd Püschel, Nathalie Daniel, Eva Bitzer, Martin Blum,Jean-Paul Renard and Christoph Viebahn. The Rabbit (Oryctolagus cuniculus): a model for mammalian reproduction and early embryology. Cold Spring Harb Protoc; published online January 27, 2010.  doi:10.1101/pdb.emo139

Все статьи автора «Козикова Лариса Васильевна»