В настоящее время не вызывает сомнений важное патогенетическое значение нарушений белкового обмена в организме беременной женщины. Это доказано многочисленными исследованиями, в том числе на субклеточном и молекулярном уровне. Вместе с тем не выяснены многие механизмы изменений азотистого обмена в зависимости от возраста беременной, характера осложнения беременности [2, с.86-88; 6, с. 496-500].

Особенно глубокие нарушения обменных процессов возникают при беременности, осложненной экстрагенитальными заболеваниями и гене­тическими нарушениями, ибо беременность, вызывающая как ни одно другое физиологическое состояние напряжение функционально-приспо­собительных механизмов организма, ферментативные и гормональные сдвиги, ведет к изменениям всех видов метаболизма, прежде всего белкового [4, с. 26-10].

Изучение обмена аминокислот в организме беременных женщин в норме и при патологии (токсикозы, гломерулонефриты) имеет важное значение для диагностики и прогноза, а также для более глубокого понимания патогенеза заболеваний [5, с. 1013-1020]. Как дефицит, так и избыток хотя бы одной аминокислоты может привести к аминокислотному дисбалансу и вызвать ограничение белкового синтеза [1, с.5-10; 3, с.31].

По поводу содержания аминокислот в крови беременных данные ли­тературы довольно противоречивы. Так, в одних работах не обнаружено существенных различий в суммарном содержании свободных ами­нокислот в крови беременных и небеременных женщин [6, с. 496-500]. Другие авторы наблюдали снижение аминокислот в крови либо в первой половине бе­ременности, либо только в конце беременности, либо в течении всей беременности. Суммарная концентрация аминокислот в крови не беременных женщин в среднем составляет 30 мг%, а у беременных к 6-8 й неделе беременности снижается до 17 мг% и удерживается примерно н таком уровне до конца беременности [4, с. 26-41].

Высказано предположение, что снижение уровня аминокислот в кров беременных связано с повышенным выделением их с мочой. Полагают, что повышение аминокислот с мочой обусловлено нарушением и реабсорбции в почечных канальцах беременной женщины [7, с. 785-790].

Целью настоящего исследования явилось определение содержания свободных аминокислот в сыворотке крови, моче, амниотической жидкости беременных женщин.

Всего обследовано 33 женщины. Из них 15 – сроком 28-30 недель в возрасте 20-22 года, беременность которых протекала без осложнений (контрольная группа); 8 женщин, сроком беременности 28-30 недель в возрасте 20 – 26 лет с диагнозом гломерулонефрит; 10 женщин, сроком беременности 16-20 недель в возрасте 38 – 44 года, относящиеся к возрастной группе риска. К возрастной группе риска относятся женщины в возрасте 35 лет и более, так как с точки зрения генетиков в этом возрасте в организме происходят структурные перестройки на молекулярном уровне (генные, хромосомные). Физиологическая беременность усиливает изменения в обменных процессах. В связи с чем на определенном этапе беременности, женщине медико-генетической консультацией показан амниоцентез – метод определения угрозы врожденного заболевания, нарушения обменных процессов, а также наследственно обусловленных генетических заболеваний еще до рождения ребенка. При изучении содержания свободных аминокислот в биологических жидкостях учитывалось время последнего приема пищи, так как экзогенные аминокислоты оказывают влияние на собственные тканевые пулы организма в течении определенного времени.

Кровь забирали из локтевой вены натощак. Сыворотку крови отделяли от эритроцитов центрифугированием (10 мин. при 3000 об/мин.). Проводили депротеинизацию. Для этого к 0,2 мл сыворотки добавляли 0,4 мл этанола. Оставляли стоять при комнатной температуре 10 мин., затем центрифугировали в том же режиме. Элюат использовали для тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Забор амниотической жидкости проводился путем пункции плодного пузыря. Центрифугировали 10 мин. при 3000 об/ мин. Для осаждения белков к 0,2 мл жидкости добавляли 0,4 мл 95 % этанола. Оставляли стоять при комнатной температуре, затем снова центрифугировали при этом же режиме. Элюат использовали для ТСХ.

Использовались разовые образцы утренней мочи. Определяли удельный вес (1018 – 1023). Непосредственно перед исследованием мочу центрифугировали (10 мин. при 3000 об/ мин.) и профильтровывали.

Образцы биологических жидкостей наносим на стартовую линию, проведенную простым карандашом на расстоянии 0,5 см от края пластинки. Нанесение проводили предварительно откалиброванными стеклянными капиллярами в виде полосок длиной 10 мм и шириной не более 2 мм, отстоящих друг от друга на 10 мм. Наносимый объем сыворотки и амниотической жидкости в виде водно-спиртового элюата -30 мкл ; мочи – 10 мкл. На каждой хроматограмме наносили наличие контролей – стандартной смеси аминокислот.

Для разделения аминокислот использовали восходящий тип развития хромматограмм с двукратным пропусканием через систему растворителей Н-бутанол – ледяная уксусная кислота (ЛУК) – вода в соотношении 3:1:1. Камеру заряжали системой растворителей за сутки до проведения хроматографии и герметично закрывали для хорошего насыщения камеры. Разгонку проводили при одной и той же температуре помещения 20 С^◦. Фронту растворителей давали подняться до уровня 8 см, после чего пластинку вынимали из камеры и высушивали. Разгонку проводили дважды.

Окраску хроматограмм проводили универсальным красителем для аминокислот кадмий-нингидриновым реактивом: 200 мл нингидрина растворяли в смеси, состоящей из 85 мл ацетона, 5 мл ЛУК, смешивали с 10 мл 1% раствора ацетата кадмия. Хроматограмму погружали в раствор красителя при комнатной температуре под тягой. Окраска развивалась в течении 2 часов. Аминокислоты окрашивались в розовый цвет разной степени интенсивности.

Для определения количественного содержания аминокислот испы­туемых смесях, пятна проявившихся аминокислот очерчивали простым карандашом. Очерченные участки счищали и помещали в пробирки, номера которых соответствовали номеру пятен на хроматограмме. В каждую пробирку приливали по 10 мл 75%-ного этилового спирта, насыщенного сульфатом меди. Пробирки закрывали, выдерживали в термостате при t = 37 С° в течении 15-20 минут, периодически перемешивали, добиваясь полного перехода окраски в раствор. Оптическую плотность стандартного и исследуемого растворов из­меряли против 75%-ного раствора этилового спирта с сульфатом меди на фотоэлектроколориметре (КФК-3) с зеленым светофильтром (540 нм). Во избежания неточности из-за возможного загрязнения, растворы перед фотометрированием фильтровали. Расчет аминокислот проводили по калибровочному графику, которые строили по калибровочным растворам аминокислот.

Результаты исследования

После поведения тонкослойной хроматографии проводили идентификацию проявившихся пятен на хроматографической пластинке. Для идентификации, пятна аминокислот сравнивали с пятнами аминокислот на стандартной шкале. Интенсивность окраски характеризовали как ярко выраженную, выраженную и в следовых количествах.

Как видно на рис 1. у первой группы обследованных в амниотической жидкости идентифицирована слабо выраженная окраска гистидина, глицина. В следовых количествах отмечены фенил аланин, треонин. На фоне выше перечисленных аминокислот интенсивнее окраска была выражена у аланина, аспарагиновой кислоты.

Рис 1. ТСХ аминокислот амниотической жидкости у женщин с возрастной группой риска.

В сыворотке крови (Рис 2.) окраска пятен аланина и аспарагиновой кислоты выражена слабо по сравнению с таковыми в амниотической жидкости. В следовых количествах отмечены гистидин, фенилаланин, треонин, метионин.

Рис 2. ТСХ аминокислот сыворотки крови у женщин с возрастной группой риска.

В моче выразительно проявились пятна у глицина, гистидина, пролина. В следовых количествах проявился в моче аланин.

Во второй группе женщин проводили хроматографию сыворотки крови и мочи. Наблюдалась четко выраженная проявление пятен в сыворотке крови аспарагиновой кислоты, лейцина и глутаминовой кислоты, треонина, фенилаланина. Слабее была выражена окраска пятен гистидина, глицина.

В моче женщин с нормальной беременностью ярко выражено наличие глицина, гистидина по сравнению с таковыми в сыворотке крови.Четко проявлены пятна глутаминовой кислоты и пролина. Выражены слабее предыдущих треонин и аспарагиновая кислота.

В III группе женщин с осложненной беременностью была проанализирована сыворотка крови (рис. 3). Отмечено выраженное проявление таких аминокислот как гистидин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, треонин. 

Рис. 3. ТСХ аминокислот сыворотки крови у женщин с осложненной беременностью.

Уровень свободных аминокислот в моче и амниотической жидкости был выше, чем в сыворотке крови, однако выраженность этих изменений различна.

Так в амниотической жидкости отмечено достоверное увеличение аланина(0,21 ммоль/л), фенилаланина (0,01 ммоль/л), глутаминовой кислоты (0,0015 ммоль/л). В сыворотке крови уровень концентрации этих аминокислот ниже на 1,5 – 2 раза. Содержание аспарагиновой кислоты (0,02 ммоль/л) в амниотической жидкости превышает в 2 раза ее концентрацию в сыворотке крови. Не наблюдалось резких изменений в содержании гистидина (0,007 ммоль/л), треонина (0,008 ммоль/л). Суммарное увеличение содержания аминокислот в амниотической жидкости может быть обусловлено усилением белкового синтеза в процессе беременности.

Содержание свободных аминокислот более выражено в моче по сравнению с их уровнем в сыворотке крови и амниотической жидкости. Наиболее значительным оказалось увеличение содержания гистидина (0,105 ммоль), глицина (0,1 ммоль/л), глутаминовой кислоты (0,01 ммоль/л) и аспарагиновой кислоты (0,03 ммоль/л)

Анализ показателей, количественное содержание аминокислот в сыворотке крови у женщин II группы – с нормальной беременностью и III группы – беременностью, осложненной гломерулонефритом отражает незначительные изменения их концентраций. Количество глицина (0,0019 ммоль/л), аспарагиновой кислоты (0,01 ммоль/л), глутаминовой кислоты (0,002 ммоль/л), фенилаланина (0,005 ммоль/л ) у женщин II и III группы было практически одинаковым. Более существенно достоверное увеличение уровня концентрации аминокислот наблюдается в моче на 10 раз. Сопоставляя показатели обследуемых женщин II и III групп, обнаружили значительное увеличение некоторых аминокислот. Достоверным отмечено повышение глицина (в 10 раз), пролина (в 2 раза), треонина (в 3,0 раз).

Обращает на себя внимание как в сыворотке так и в моче лейцина. У женщин с нормальной формой течения беременности лейцин не обнаружен. Его концентрации в сыворотке крови составляют – 0,004 ммоль /л, в моче – 0,0038 ммоль/л. Наряду с этим у женщин III группы отмечено увеличение содержания пролина в моче в 2 раза (0,11 ммоль /л). В норме экскреция пролина составляет 0,088 ммоль /л.

Выявленные изменения позволяют заключить прямую зависимость уровня содержания концентрации аминокислот в сыворотке крови и их уровень экскреции с мочой. При физиологической беременности развивается адаптационно – приспособительные изменения функционального состояния почек, направленные на обеспечения роста и развития плода.

Определение свободных аминокислот в крови, амниотической жидкости, моче беременных женщин может дать дополнительные объективные сведения для оценки тяжести заболевания, его течения и прогноза, а так же способствовать постановке диагноза и выработке рациональных методов терапии с учетом нарушений аминокислотного обмена.

Выводы

1. На основании аминокислотного состава биологических жидкостей у женщин с возрастной группой риска, пришли к заключению , что высокое суммарное содержание аминокислот в амниотической жидкости обусловлено усилением обменных процессов, направленные на развитие и рост плода

2. Полученные данные по изучению общего количества свободных аминокислот у беременных женщин дают возможность говорить о снижении их общей концентрации в сыворотке крови, что может быть обусловлено повышенным выделением их с мочой.

3. Отмечено, что количественный состав аминокислотного фонда сыворотки крови, мочи идентичен у беременных женщин с нормально протекающей и осложненной беременностью.

4. Установлена зависимость между экскрецией аминокислот и степенью осложнения беременности. Экскреция аминокислот значительно выше у беременных женщин с гломерулонефритом, чем у женщин с нормально протекающей беременностью.

1. Ашмарин И.П., Бассалык Л.С. Элементы патологической физиологии и биохимии. М.: Изд. МГУ. 1992.
2. Андреева Е.И., Кондратюк С А., Пушня Г.О. Изучение физиологии и патологии женского организма и детей раннего возраста. 1975.
3. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим Л.И. Протеолиз  в норме и при патологии. Киев. 1988.
4. Трубникова Л.И. Идентификация скрытой периодичности в аминокислотных последовательностях белковых семейств // Биохимия. 2006. № 71.
5. Челина В. Количественная оценка структурных и функциональных ограничений аминокислотных замен при эволюции белков // Биохимия. 2005. № 70.
6. Chuang C.K. Free amino acids in full-term and pre-term human milk and infant formula // J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005. № 40.
7. Evans R.W. Maternal and fetal amino acid concentrations and fetal outcomes during pre-eclampsia // Reproduction. 2003. № 125.

Все статьи автора «Сатаева Татьяна Павловна»