В настоящее время идет процесс вытеснения местных пород животных высокопродуктивными промышленными породами. С одной стороны, происходит повышение продуктивности животных, с другой – потеря ценных генов, которые могут оказаться востребованными в будущем при изменении условий содержания животных. Кроме того, местные генофондные породы отличаются приспособленностью к инфекциям благодаря наличию генов устойчивости, закрепившихся в геноме в ходе эволюции. Потеря этих генов несет определенные риски для животноводства. Поэтому проблеме сохранения генофондных животных уделяется большое внимание [1, с. 21]. Овцеводство играет значительную роль в современном животноводстве как источник целого ряда продуктов. Во многих странах сохранению генофондных популяций овец уделяют серьезное внимание. В частности, в Германии поддерживается целая группа малочисленных популяций овец. Методы молекулярной генетики способны выявить генетические особенности популяций, определить взаимоотношения между группами животных, оценить риски появления инбредной депрессии при достижении критически малого числа особей в популяции [2, с. 44; 3, с. 37]. Современные компьютерные программы позволяют рассчитать различные популяционно-генетические параметры, такие как средняя гетерозиготность [4; 5], генетические расстояния у животных [6; 7]. Они широко используются при генотипировании не только животных, но и  микроорганизмов [8].

Методика

Основным методом исследования был молекулярно-генетический подход, основанный на использовании меченого дезоксигенином зонда (ГТГ)5. Данный зонд выявляет полиморфные участки в геноме сравниваемых особей. Геномную ДНК овец выделяли стандартным методом с использованием протеиназы К и фенола. Очищенную ДНК растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). В начале исследований оказалось, что получение фингерпринтов на геномной ДНК овец сопряжено с рядом трудностей, которые необходимо было преодолеть. Прежде всего, нужно было найти оптимальное сочетание фермента рестрикции, геномного зонда, условий гибридизации, отмывок фильтров, детекции сигнала. Сравнение ряда ферментов, узнающих 4 пары оснований (такие ферменты рестрикции наиболее подходят для получения фингерпринтов) показало, что наилучшим является НаеIII. Этот фермент характеризуется стабильностью, сравнительно устойчив к примесям в реакционной смеси и давал несколько лучшее разрешение, чем, например HinfI  и AluI. В противоположность HinfI, выбранная нами рестриктаза никогда не выявляла дополнительных неспецифических полос (звездная активность). Вкратце, методика сводилась к следующим стадиям: расщепление ДНК ферментом НаеIII, электрофорез в 0,8% агарозном геле при напряжении 60В в течение 48 часов, перенос фрагментов ДНК на нейлоновый фильтр в приборе вакуумного перенеса, гибридизация ДНК на фильтре с меченым зондом (ГТГ)5, детекция мест связывания зонда на фильтре и использованием антитела к дезоксигенину.

Были изучены 10 популяций овец, принадлежащих четырем породам, разводимым в Германии. Количество особей в каждой группе колебалось от 10 до 30. Известно, эта страна располагает уникальной коллекцией локальных пород овец с четкой регистрацией происхождения и процесса разведения. Одной из таких пород является порода Лайнешаф (названная по имени реки, протекающей большей частью в земле Нижняя Саксония). Имеется два типа животных этой породы: новый и старый. Животные старого типа были в свое время вывезены в Польшу, а затем снова импортированы в страну. Редкие сохраняемые породы животных разводятся, в основном, на частных фермах. Фермеры на каждую голову генофондных животных получают дотацию из федерального и земельного бюджета и поэтому с желанием ведут такое хозяйство. Старый тип овец Лайнешаф разводится в трех популяциях. В нашем случае, это популяции VII, VIII и IX. Каждая из этих групп животных содержится изолированно у разных фермеров. Животные нового типа также содержатся на изолированных фермах и распределены в популяциях  I, II, III и IV. Согласно сохранившимся старым записям, есть некоторые свидетельства генетического влияния на некоторые из этих популяций других пород, обозначенных в наших исследованиях как популяции V, VI и X. Задачей работы было подтвердить или опровергнуть данные о происхождении животных.

Результаты

Используя полученные данные по распределению полос (фрагментов ДНК) в разных популяциях животных, можно рассчитать коэффициенты сходства (доля общих полос у сравниваемых животных) во всех комбинациях овец. Таблица 1 демонстрирует межпопуляционные коэффициенты сходства у старого и нового типа овец Лайнешаф, длинношерстных Мериносов, Остфризской молочной пород и Текселей.

Таблица 1 – Коэффициенты сходства в популяциях овец пород Лайнешаф, длинношерстных Мериносов, Остфризской молочной пород и Текселей по данным картин фингерпринтинга

* -  номера популяций в данном исследовании обозначены согласно разделу «Методика»

Наиболее высокий коэффициент сходства обнаруживался в двух популяциях породы Лайнешаф (популяции I и III). При сравнении групп животных породы Лайнешаф с Остфризскими молочными овцами были получены значения BS в диапазоне 0,23 – 0,39, с овцами Тексель – 0,1 – 0,26. Длинношерстные Мериносы показали высокое сходство с одной из популяций Лайнешаф старого типа, содержащейся в районе Айхсфельда  (BS = 0,55). Нужно отметить, что животные этой группы содержатся без ведения племенной книги и в процессе разведения скрещивались с длинношерстными Мериносами. Мы не наблюдали высокого сходства между популяциями животных породы Лайнешаф. Так, в группах овец нового и старого типов коэффициент сходства колебался от 0,20 до 0,37. Исключением была только одна пара с особенно высоким генетическим сходством (популяции нового типа I и III). Генетическая дивергенция наиболее выражена в паре Тексель – популяция IX старого типа овец Лайнешаф (низкий коэффициент сходства равный 0,1).

В качестве меры генетической дивергенции между группами животных мы использовали генетическое расстояние по Роджерсу. Полученный цифровой материал по генетической дивергенции суммирован в таблице 2.

Таблица 2 – Генетическое расстояние по Роджерсу в популяциях овец

Таблица показывает, что в ряде случаев отмечается согласование результатов анализа с данными таблицы 1, однако в случае с популяциями I и III нет прямой связи между данными этих таблиц. Расчет генетического расстояния по Роджерсу предполагает вычисление частот встречаемости всех полос на фильтрах, в то время, как расчет коэффициента сходства основан на учете лишь общих полос и технически осуществляется проще. Сравнение данных таблиц 1 и 2 с известными фактами выведения и разведения пород и популяций овец указывает на большую надежность измерения генетической дивергенции по данным коэффициента сходства, чем по генетическим расстояниям по Роджерсу. Во всех последующих экспериментах мы применяли именно этот подход.

В связи с тем, что при расчете генетических расстояний мы использовали данные по частотам встречаемости полос, эти же данные было легко применить и для выяснения внутрипопуляционной генетической вариабельности (гетерозиготность) в популяциях овец. Данные по средней гетерозиготности в популяциях овец содержатся в таблице 3.

Таблица 3 – Внутрипопуляционная генетическая вариабельность (гетерозиготность) в популяциях овец по данным картин фингерпринтинга

Овцы Тексель отличались чрезвычайно низкой средней гетерозиготностью (Н = 0,66) в сравнении с большинством других изученных групп животных. Находящаяся на грани полного исчезновения местная порода Лайнешаф характеризовалась достаточно высоким генетическим полиморфизмом, отражающем высокие значения средней гетерозиготности почти во всех изученных популяциях (за исключением популяции I овец нового типа с уровнем гетерозиготности всего 0,67).

1. Киселева Т.Ю., Подоба Б.Е., Заблудовский Е.Е., Терлецкий В.П., Воробьев Н.И., Кантанен Ю. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. 2010. №6. С.20–25.
2. Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Оценка генетического разнообразия в популяциях кур на основе геномной дактилоскопии // Сельскохозяйственная биология. 2002. №6. С.43–46.
3. Митрофанова О.В., Тыщенко В.И., Дементьева Н.В., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. Исследование особенностей генетической гетерогенности пород и экспериментальных популяций кур на основе анализа полиморфизма ДНК // Доклады РАСХН. 2007. №6. С.36–38.
4. Stephens J.C., Gilbert D.A., Yuhki N., O’Brien S.J. Estimation of heterozygosity for single-probe multilocus DNA fingerprints // Mol. Biol. Evol. 1992. Vol.9. P.729-743.
5. Rogstad S.H., Pelican S. GELSTATS: a computer program for population genetics analysis using VNTR multilocus probe data // BioTechniques.-1996. V.21. P.1128–1131.
6. Jin L., Chakraborty R. Estimation of genetic distance and coefficient of gene diversity from single-probe multilocus DNA fingerprinting data // Mol. Biol. Evol. 1994. V.11. P. 120–127.
7. Lynch M. Analysis of population genetic structure by DNA fingerprinting // In: “DNA fingerprinting: approaches and applications”. Basel. 1991. Birkhauser Verlag. P.113–126.
8. Terletski V. P., Schwarz S., Carnwath J., and Niemann H. Subtracted restriction fingerprinting – a tool for bacterial genome typing // BioTechniques. 2003. V.34. P.304–313.

Все статьи автора «Терлецкий Валерий Павлович»