В настоящем сообщении приводятся данные по стандартизации подобного типа мази, содержащей, наряду с грязью «Ахтала», фуксин. Учитывая, что грязь «Ахтала» обладает определенными сорбционными свойствами, необходимо было на начальной стадии исследования подобрать растворитель, обеспечивающий максимальную степень извлечения фуксина из мази. Исследовалась целесобразность применения в качестве экстрагентов лиофильных спиртов С₁-С₄ в чистом виде и с добавкой органических кислот, а также ряд лиофобных растворителей. Наиболее целесообразным оказалось использование метанола, содержащего 10% конц. уксусной кислоты. При этом колличество необротимо сорбированного фуксина находилось в пределах 0,0078 г/г абсолютно сухой массы лечебной грязи. Извлечения, в этих условиях, в определенном разведение, непосредственно из самой грязи «Ахтала» имеют поглощение в УФ-свете в области 240-350 нм., максимум же поглощения раствора фуксина в этом же растворителе в той же степени разведения находится в области 550-560 нм., что дает возможность проведения спектрофотометрического анализа.

Методика определения. 0,5 г. мази (т.н.) помещается в колбу с обратным холодильником, туда же заливается 50 мл. метилового спирта, содержащего 10% конц. уксусной кислоты. Экстракция проводится при температуре 50 ± 2⁰ в течении одного часа. Извлечение переносится в 100 мл. мерную колбу и доводится до метки тем же растворителем, который был уже использован для промывания экстракционной колбы. Охлажденное до комнатной температуры извлечение отстаивается в течении двух часов либо центрифугируется с использованием стеклянной пробирки. 0,1 мл. извлечения (т.о.) переносится в 25 мл. мерную колбу и доводится до метки тем же растворителем. Оптическая плотность раствора определяется при длине волны 550-560 нм. Расчет содержания фуксина в растворе проводится по сравнению с величиной оптической плотности соответствующего стандартного раствора.

Данные по валидации предлагаемой методике анализа приводятся в таблицах 1-5. В таблице 1 показанны результаты анализов, являющихся доказательством существования необратимой сорбции определенного колличества фуксина. Линейность определения находится в пределах 0,08-1,2 мг%.

Таблица1

Правильность определения

Таблица 2

Определение сходимости результатов анализа

Таблица 3

Воспроизводимость (метрологическая характеристика)

Таблица 4

Специфичность (добавка метиленового синего 0,2%)

Таблица 5

Промежуточная претензиозность

Опыт их использования насчитывает не одно тысячелетие, богатым источником природных БАВ является Ахтальская лечебная грязь вулканического происхождения, которая содержит комплекс минеральных и органических веществ, некоторые из которых не характерны для грязей осадочных пород [1], Повышенное содержание минеральных веществ и живых организмов делает эту грязь эффективной при лечение многих заболеваний, в частности трамватологических, нервной системы, опорно двигательного аппарата, гинекологических, проктологических, в дерматологии и т.д. Однако, грязи недостаточно стабильны в процессе транспортировки и хранения, могут разрушаются под воздействием факторов внешней среды, теряя свои лечебные свойства. Кроме того, в виде аппликаций, компрессов и в комплексе с методами физиотерапии имеют определенные ограничения и противопоказания, особенно у лиц пожилого и старческого возраста. Следует учитывать и весьма большой расход грязи на одну процедуру (не менее 200 кг), а возможность регенерации весьма ограниченна. Использование препаратов, содержащих БАВ грязей [2-4], обеспечивает существенное уменьшение расхода , позволяет расширить показания к пелоидотерапии, получить терапевтический и экономический эффект. При проведение количественного определения наиболее целесообразным, как и ранее [5], оказалось использование метанола, содержащего 10% конц. уксусной кислоты. При этом колличество необротимо сорбированного бриллиантового зеленого (БЗ) находилось в пределах 0,0065-0,0069г/г абсолютно сухой массы лечебной грязи. Извлечения, в этих условиях, в определенном разведение, непосредственно из самой грязи «Ахтала» имеют максимум поглощения в УФ-свете в области 240-350 нм, максимум же поглощения раствора БЗ в этом же растворителе, в той же степени разведения, находится в области 430-435 нм, что дает возможность проведения спектрофотометрического анализа.

Методика определения. 0,5 г. мази (т.н.) помещается в колбу с обратным холодильником, туда же заливается 50 мл. метилового спирта, содержащего 10% конц. уксусной кислоты. Экстракция проводится при температуре 50 ± 2⁰ в течении одного часа. Извлечение переносится в 100 мл. мерную колбу и доводится до метки тем же растворителем, который был уже использован для промывания
экстракционной колбы. Охлажденное до комнатной температуры извлечение отстаивается в течении двух часов либо центрифугируется с использованием стеклянной пробирки. 0,1 мл. извлечения (т.о.) переносится в 25 мл. мерную колбу и доводится до метки тем же растворителем. Оптическая плотность раствора определяется при длине волны 430-435 нм. Расчет содержания (БЗ) в растворе проводится по сравнению с величиной оптической плотности соответствующего стандартного раствора. Данные по валидации предлагаемой методике анализа приводятся в таблицах 1-5. В таблице 1 показанны результаты анализов, являющихся доказательством существования необратимой сорбции определенного колличества (БЗ). Линейность определения находится в пределах 0,08-1,0 мг%.

Таблица1. Правильность определения

Таблица 2. Определение сходимости результатов анализа

Таблица 3. Воспроизводимость (метрологическая характеристика)

Таблица 4. Специфичность (добавка метиленового синего 0,2%)

Таблица 5. Промежуточная претензиозность

Барбарис обыкновенный – колючий кустарник высотой до 2,5 м с хорошо развитой корневой системой.На стеблях находятся множество трех- пятираздельных колючек,  стволы покрыты сероватой корой. Листья эллиптические, длиной до 4 см, с мелкопильчатым краем пластинки, короткими черешками, плотные. Цветки небольшие, ярко-желтые, в соцветиях длиной до 6 см. , с двойным шестичленным околоцветниом,  чашелистики отличаются от лепестков по внешнему виду. Плоды – продолговатые, ярко-красные ягоды длиной до 12 мм. Цветет в мае-июне. Плоды созревают в августе-сентябре и остаются на кустах до зимы. Берберин  содержится в корнях барбариса обыкновенного. По литературным данным  в Berberis vulgaris, с  содержанием  до 0,5- 1,5%, а так же  во многих растениях семейств лютиковых (Ranunculaceae), барбарисовых (Berberidaceae), луносемянниковых (Menispermaceae), рутовых (Rutaceae) и др . Биологическое действие: Снижает артериальное давление, ослабляет сердечную деятельность, вызывает сокращение гладкой мускулатуры матки и кишечника, усиливает отделение желчи.[ 1-3 ].

В Грузии барбарис обыкновенный встречается в лесах средней части гор, по лесным опушкам, по берегам рек. Барбарис распространён почти во всех районах Грузии, кроме Джавахетии и Месхетии.

При подборе системы для хроматографирования наиболее эффективным оказалось разделение в тонком закрепленном слое силикагеля в системе н-бутанол-ледяная уксусная кислота-во­да (10:1:3). При этом на хроматограмме наблюдается 4 резко очерченных пятна, одно из которых (Rf=0,43) находится на уровне стандартного образца берберина. Идентичность на­ходящегося в этом пятне вещества с берберином была доказа­на методами многократного хроматографирования, добавок берберина на стартовую полосу, и ИК – спектрофотометрированием элюата. Для элюации из пятна берберина были использованы, как органические растворители, так и растворы минеральных кислот. При этом оказалось, что наиболее перспективно при­менение 10%раствора уксусной кислоты, что позволяет поднять коэффициент элюации до 96%. Благодаря тому, что получаемые при этом элюаты окрашены в слабожелтый цвет, возникает во­зможность их непосредственного фотометрирования, При опреде­лении индукционного периода выяснилось, что получаемые элюаты сохраняют стабильную окраску в течение 48 часов.

Хроматографирование проводилось в тонком слое на сте­клянных пластинках размером 9 х 13см. В качестве носителя использовался силикагель марки ЛСЛ₂₅₄ или КСК с добавкой гипса и воды (соотношение силикагель-гипс-вода = 4,5:0,5:12). Пластинки сушатся на воздухе, а затем активируются при 100-110⁰ в течение 30 минут.

Построение градуировочного графика.

А. Для приготовления стандартного раствора О,5г (т.н.) 2-ды перекристализированного из спирта фармакопейного берберина бисульфата растворяется в метаноле в 100мл мерной колбе.

Микропипеткой определенные объемы данного раствора на­носятся на пластинку с целью получения концентраций при элюации в пределах 0,01-0,5мг%.

Б. После хроматографирования и высушивания пластинки на воздухе участки сорбента желтого цвета, содержащие берберин, соскабливаются с пластинки в 50мл стаканчики и алка­лоид элюируется по порциями по 8-10мл 8 раз (до получения бесцветного извлечения) 10%-ой уксусной кислотой. Полученные уксусно-кислотные извлечения фильтруются через двойной бумажный фильтр в 100мл мерные колбы, после чего объем раствора доводится 10%-ой уксусной кислотой до метки. Раство­ры спектофотометрируются при длине волны l=345нм  по отношению к раствору 10%-ой уксусной кислоте.

Закон Бугера-Лаьерта-Бера выполняется в пределах 0,01-0, 3мг%.

Определение содержания берберина в сырье.

а) 10г тонкоизмельченных корней барбариса обыкновенного (т.н.) просеянных через сито с диаметром отверстий 1мм, вносятся с колбу с обратным холодильником, куда предварительно зали­вается 200мл 95°спирта,содержащего 5% уксусной кислоты. Смесь выдерживается при температуре кипения в течение 2-3 часов.Полнота извлечения контролируется качественными реакциями  и хроматографией в тонком слое последующих сгущеных извлечений. Полученный спиртовый раствор суммы алкалоидов фильтруется через бумажный фильтр и сгущается под вакуумом. Из сгу­щенного спиртового экстракта  отбирается 0,05-0,2 мл раствора ( взависимости от концентрации) и наносится на пластинку , на паралелную полосу наносится I капля 1% стандартногораствора берберина бисульфата. После храматографирования и высушивания пластинки на воздухе, от­мечается пятно, расположенное на уровне стандартного обра­зца берберина. После чего ход анализа идентичен описанному при построении градировочного графика берберина (часть Б). Содержание берберина в сырье в процентах (X₁)- опреде­ляется по формуле:

                                            (1)

А – навеска сырья) мг;

V₁ - объем полученного сгущенного спиртового раствора, нанесен­ного на пластинку, мл;

V₂  -объем полученного сгущенного спиртового экстракта, мл;

В – количество берберина, соответствующее замеренной оптиче­ской плотности по градуировичному графику мг%.

б) Содержание берберина в сырье можно определять и без предварительного построения градировочного графика бербе­рина. В этом случае на хромотографическую пластинку рядом с исследуемым  сгущеным раствором наносится 0,1мл 0,1% раствора ста­ндартного образца берберина в метаноле, приготовленного ана­логично раствору для построения градуировочного графика. После хроматогрефирования пластинки, в стаканчики элюируются пятна берберина  исследуемого раствора и  стандартного образца. Далее поступают аналогично построению градуировочному графику – часть Б, измеряя экстинцию раствора исследуемо­го и стандартного образца. В этом случае содержание бербери­на в сырье рассчитывают по формуле:

 , где                           (2)

А – навеска сырья в г;

V₁- объем сгущенного спиртового раствора суммы алкалоидов, мл;

V₂- количество сгущенного спиртового раствора, нанесенного

на пластинку для хроматографирования_s мл;

V₃- объем уксусно-кислых извлечений, полученных при элюации берберина с сорбента, мл; (исслед. раствор);

С_ст - концентрация раствора стандартного образца берберина в уксусно-кислотных извлечениях, г/мл;

Д_ст- оптическая плотность раствора стандартного образца берберина;

Д_х - оптическая плотность раствора.

Определение содержания берберина в экстрактах

0,2 мл  подготовленного спиртового кислого извлечения либо спиртового экстракта из корней барбариса обыкновенного наносится на пластинку для хроматографирования. Дальнейший ход работы аналогичен работе при построении градировочного графика, часть Б.

Расчет процентного содержания берберина в экстракте проводится по формуле

, где                              (3)

V₁   - объем исследуемого раствора, нанесенного на пластинку, мл;

V₂  - объем уксусно-кислотных извлечений, полученных после элюации берберина с пластинки, мл (исслед. раствор);

С_ст - концентрация раствора стандартного образца берберина в уксуснокислотных извлечениях , г/мл;

Д_ст - оптическая плотность стандартного раствора;

Д_х - оптическая плотность исследуемого раствора.

Приводим данные по валидационным характеристикам.

Воспризводимость метода (метрологическая характеристика)  определения берберина в сырье полупродуктах производства, в экстрактах показала, что точность метода при проведении в 1-но кратной  повторности с Р= 90% составляет +6,35%.

Показатели  правильности определения  в одной повторности соответствуют  этим  данным (таблица1).

Правильность определения

Таблица1

Линейность определения сохраняется практически в тех же пределах, как указано выще. Определение сходимости результатов анализа показало ощибку в пределах  3,4- 5,3%,(отн.). Специфичность методак изучалась при добавление алкалоидов колхамин и колхицин  в количестве   0,2%, относительное отклонение находилось в пределах 3,5-4,9%. Промежуточная претензиозность( 2 аналитика , 6 дней) показала относительное отклонение в пределах 3,8-4,9%.

Содержание берберина в корнях растения  в зависимости  от времени и места сбора колеблется в пределах 0,6- 1,2% .

, где (1)

V – объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование извлечения, мл;
 – объем раствора перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл; 
0,004157 – количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл раствора перманганата калия (0,02 моль/л) (в пересчете на танин), г; 
250 – общий объем извлечения, мл; 
25 – объем извлечения, взятого для титрования, мл.
m – масса сырья, г;
W – потеря в массе при высушивании сырья, г; 
Для количественного определения дубильных веществ методом спектрофотометрии, около 1 г (точная навеска) исследуемого растительного сырья, измельченного до размера частиц, проходящих через сита с размером отверстий 1 мм, помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 мл, добавляли 25 мл смеси ацетон-вода в соотношении 7:3 (70% раствор ацетона). Колбу закрывали и помещали в лабораторное перемешивающее устройство (ЛАБ ПУ-2, Россия) на 60 минут. Полученное извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили объем до метки 70% раствором ацетона (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 10 мл помещали 1 мл раствора А, объем раствора в колбе доводили водой очищенной до метки (раствор Б).
0,5 мл раствора Б помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, добавляли 2 мл воды очищенной, 0,25 мл реактива Фолена-Чокальтеу, 1,25 мл 20% раствора натрия карбоната и доводили объем раствора водой до метки. Колбу оставляли на 40 минут в защищенном от света месте. Оптическую плотность раствора определяли при длине волны 750 нм. В качестве раствора сравнения использовали смесь реактивов без добавления извлечения.
Содержание дубильных веществ в извлечениях из растительного сырья рассчитывали по значениям градуировочного графика для построения которого, использовали 0,1 мг/мл раствор стандартного образца CO танина. С этой целью 0,05 г (точная масса) CO танина помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 30 мл воды и объем в колбе доводили тем же растворителем до метки (раствор A). 
1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл. Объем раствора в колбе доводили водой до метки (раствор Б).
Серию растворов, содержащих по 1; 2; 3; 4; 5 мкг/мл CO танина готовили, помещая навески раствора Б в мерные колбы вместимостью 10 мл, прибавляли реактив Фолина–Чокалтеу и 20% водный раствор натрия карбоната, объем растворов в колбе доводили водой до метки. 
Растворы перемешивали, колбы укупоривали и выдерживали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 40 мин.
Оптическую плотность полученных растворов определяли спектрофотометрически в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при длине волны 725 нм относительно раствора сравнения.
Раствор сравнения представлял собой смесь реагентов без добавления CO танина (раствор B). 
По результатам проведенных исследований строили график зависимости оптической плотности от концентрации танина (рис.1). 

С учетом полученных значений рассчитывали сумму дубильных веществ, в пересчете на танин по формуле:

, где

с – содержание дубильных веществ, найденное по градуировочному графику, мкг/мл;
F – фактор разведения;
а – навеска сырья, г;
b – потеря в массе при высушивании (%).

Результаты
Результаты количественного определения дубильных веществ методом титрования представлены в табл. 1.

Масса навески растительного сырья, г	Объём перманганата калия (0,02 моль/л), израсходованного на титрование полученного извлечения из растительного сырья, мл	Количество дубильных веществ, % (Xi)	Метрологические характеристики
2,10250	7,4	15,34892	= 15,72%  0,154 Δ = 0,395 ε = 2,52% Sr = 0,024
2,03255	7,4	15,21262
2,18345	8,2	15,84713
2,24350	8,6	16,24333
2,12465	8,0	15,85257
2,07055	7,6	15,80574

Среднее значение содержания дубильных веществ в сырье составило 15,7%. Рассчитанное значение величины относительного стандартного отклонения (0,024%), которое не превышает 2%, что характеризует удовлетворительную сходимость полученных результатов.
Для определения правильности методики использовали метод добавки. С этой целью в колбу для титрования добавляли по 1 мл 0,05%, 0,1% и 0,15% CO танина и титровали трижды для каждого случая. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 2.

Количество добавленного СО танина, г	Масса сырья, г	Рассчитанноеколичество дубильных веществ, г	Найденное количество дубильных веществ, г	Открываемость, %	Метрологические характеристики
0,0005	2,2435	0,0357	0,0353	98,87	= 99,91%  1,198  0,399 tрасч.=0,23 tтабл.=2,31
	2,1247	0,0339	0,0340	100,29
	2,0706	0,0330	0,0337	102,12
0,001	2,2435	0,0362	0,0357	98,61
	2,1247	0,0344	0,0340	98,84
	2,0706	0,0335	0,0336	100,51
0,0015	2,2435	0,0367	0,0366	99,73
	2,1247	0,0349	0,0353	101,14
	2,0706	0,0340	0,0337	99,12

Полученные результаты свидетельствуют о том, что рассчитанный коэффициент Стьюдента меньше табличного значения и методика не содержит систематической ошибки, что позволяет сделать вывод о ее правильности.
Для изучения линейности определяли зависимость найденных значений количественного содержания дубильных веществ от навески исследуемого растительного сырья. С этой целью проводили количественное определение танинов в шести навесках воздушно–сухого сырья манжетки обыкновенной, отличающихся по массе (табл. 3).

По полученным в ходе проведенных исследований данным строили график зависимости определенного содержания дубильных веществ от массы навески исследуемого растительного сырья (рис. 2) и рассчитывали коэффициент корреляции.

Рассчитанный коэффициент корелляции не превышал 0,95, что свидетельствует о линейности результатов определения содержания исследуемых веществ от массы навески анализируемого растительного сырья в обозначенном интервале концентраций.
Результаты количественного определения дубильных веществ в воздушно сухом сырье травы манжетки обыкновенной методом спектрофотометрии представлены в табл. 4.

Масса навески, г	Оптическая плотность раствора	Содержание дубильных веществ по градуировочному графику мкг/мл	Найденное количество дубильных веществ, % (Xi)	Метрологические характеристики
1,02755	0,5957	7,30920	7,87340	= 7,84%  0,11 Δ = 0,28 ε = 3,61% Sr =0,034%
0,99745	0,6130	7,52147	8,34656
1,0068	0,5678	6,96687	7,65932
0,99580	0,5742	7,04539	7,83120
1,0060	0,5750	7,05521	7,76261
1,00670	0,5617	6,89202	7,57779

Среднее значение содержания дубильных веществ в растительном сырье составляет 7,8% при относительном стандартном отклонении (0,034%), не превышающем 2%, что характеризует удовлетворительную сходимость результатов.
Для определения правильности методики использовали метод добавки. С этой целью в колбу с первичным ацетоновым извлечением добавляли по 1 мл 0,05%, 0,1% и 0,15% раствора CO танина и далее проводили количественное определение дубильных веществ трижды для каждой концентрации. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 5.

Количество добавленного СО танина, г	Масса сырья, г	Рассчитанное количество дубильных веществ, г	Найденное количество дубильных веществ, г	Открываемость, %	Метрологические характеристики
0,0005	1,0068	0,0794	0,0803	101,13	= 99,96%  0,948  0,316 tрасч.=0,13 tтабл.=2,31
	1,0060	0,0794	0,0790	99,50
	1,0276	0,0811	0,0804	99,14
0,001	1,00680	0,0799	0,0798	99,87
	1,00600	0,0799	0,0807	101,00
	1,02755	0,0816	0,0823	100,85
0,0015	1,00680	0,0804	0,0808	100,50
	1,00600	0,0804	0,0792	98,51
	1,02755	0,0821	0,0814	99,15

Полученные результаты свидетельствуют о том, что рассчитанный коэффициент Стьюдента меньше табличного значения и методика не содержит систематической ошибки, что позволяет сделать вывод о ее правильности.
Линейность методики оценили при построении градуировочного графика. Коэффициент корреляции R при этом не превышал 0,95, что говорит о линейности методики.
Выводы
В ходе проведенных исследований было установлено, что предложенные методики обладают удовлетворительной сходимостью, правильностью и линейностью.