Цель наших исследований заключалась в подтверждении генетической близости четырех пород коз и сравнении двух популяций одной породы, разводимых продолжительное время в разных странах.

Методика

В качестве молекулярного маркера использовали меченый дезоксигенином олигонуклеотид (ГТГ)5. ДНК выделяли из крови коз фенольно-детергентным способом. Объектом исследования служили образцы ДНК, выделенной из крови 75 коз 4 пород: Тогенбургер, Белая немецкая, Бурая немецкая и Тюрингская лесная. Последняя относится к числу малочисленных генофондных пород и включена в немецкий национальный реестр генофондных пород в соответствии с европейской программой сохранения биоразнообразия (Council Regulation – ЕЕС No 2078/92). Тогенбургеры представлены немецкой популяцией и популяцией из Швейцарии. ДНК расщепляли рестриктазой НаеШ, полученные фрагменты ДНК разделяли по размеру в агарозном геле, а затем переносили на нейлоновый фильтр. В ходе реакции молекулярной гибридизации меченый олигонуклеотид избирательно связывался с некоторыми фрагментами ДНК. Данные места на фильтре становились видимыми в виде полос (фрагменты ДНК) после проведения иммунохимической реакции с использованием цветных красителей. Методические детали были изложены ранее [4; 5]. Каждое животное характеризуется определенным набором полос (ДНК-фингерпринт) и отличается от других особей. Подсчитывается частота встречаемости одного и того же фрагмента у разных особей внутри популяции и между популяциями. Анализ проводился с использованием компьютерной программы RFLPscan, которая позволяет объективно определить положение фрагментов ДНК у каждого животного. Расчеты частот встречаемости фрагментов ДНК и другие популяционно-генетические параметры рассчитывали с использованием программы Gelstats [8]. Данная программа рассчитывает значительное число популяционно-генетических параметров, таких как частоты аллелей, коэффициенты сходства в популяциях животных и между популяциями, значения средней гетерозиготности по всем выявляемым фрагментам ДНК, подразделенность популяции на субпопуляции и т.д. Используя значения коэффициентов сходства, рассчитывали индекс различия между популяциями.

Результаты

Интересной особенностью полученных фингерпринтов у коз, в отличие от всех ранее изученных нами видов животных, было наличие очень интенсивно проявляющегося фрагмента ДНК у всех особей в районе длин фрагментов 8400 пар оснований ДНК. Помимо этого мономорфного фрагмента имелось еще несколько фрагментов ДНК‚ которые встречались с высокой частотой, доходящей до значений 0,9. Эти фрагменты оказали существенное влияние на конечные результаты при расчете популяционно-генетических параметров. Например, коэффициенты сходства (КС) внутри пород (таблица 1) оказались довольно высокими (при сравнении с данными для других видов животных).

Сравнение пород проводили попарно на отдельных фильтрах. Это необходимо для нивелирования различной интенсивности проявления фрагментов ДНК в отдельных экспериментах. Поэтому значения КС для одной и той же породы (популяции) на разных фильтрах могут несколько отличаться (таблица 1). Генофондная порода Тюрингская лесная во многих случаях при попарном сравнении с другими породами показывала повышенные значения КС, что говорит о сужении генетического разнообразия в этой породе (значения КС варьировали на разных фильтрах от 0,48 до 0,58). Особняком стояла популяция Тоггенбургеров, которая содержится изолированно на протяжении длительного времени в Швейцарии. В этой популяции коэффициент сходства был выше и достигал значений 0,61 (таблица 1). Длительное разведение в «себе» популяции швейцарских Тоггенбургеров привело к накоплению генетических различий с намецкими Тоггенбургерами. Тюрингская лесная порода характеризовалась пониженными значениями КС при сравнении с другими породами, что свидетельствует об определенном генетическом удалении данной породы от остальных пород. Генетически наиболее близкими явялются Белая и Бурая немецкие породы коз с индексом различия всего 0,005 (таблица 1).

Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры в популяциях коз четырех пород

ТЛ – Тюрингская лесная, ТГ – Тоггенбургер, ТГшв – Тоггенбургер, популяция из Швейцарии, БН – Белая немецкая, БуН – Бурая немецкая. КС – коэффициент сходства. * Р<0,05 (сравнение КС внутри и между популяциями).

Прямым подтверждением сужения генетического разнообразия в швейцарской популяции Тоггенбургеров и генофондной породы Тюрингская лесная являются относительно низкие значения гетерозиготности – 0,40 и 0,46, соответственно (таблица 2). Данный показатель у Бурой немецкой породы достигал значения 0,59. Несмотря на то, что в швейцарской популяции Тоггенбургеров выявляется наибольшее число локусов – 8,36, гетерозиготность находится на низком уровне, так как отмечается малое число аллелей на один локус – 3,23 (таблица 2).

Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость изученных пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.

Таблица 2 – Внутрипопуляционный генетические параметры в популяциях коз

*P – вероятность того, что две особи из популции будут иметь одинаковое распределение фрагментов ДНК на фильтре.

Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.

В последние годы в мировой селекции животных и растений происходят кардинальные изменения, связанные с внедрением и интенсификацией геномной технологии. Она уже освоена и успешно применяется в селекционных программах большинства стран, в том числе и России. Изучение генетической изменчивости популяций в настоящее время широко используется для повышения эффективности селекции, выяснения истории формирования существующих пород и планирования работы в генофондных популяциях [1; 2; 3]. Накопление фундаментальных знаний о породообразовательных процессах способствует дальнейшему совершенствованию существующих пород рыб и применению эффективных приемов для  ускорения темпов селекции. Исследование полиморфизма мини- и микросателлитных ДНК дает возможность надежно и точно определять генетическое разнообразие внутри и между популяциями [4; 5;]. Снижение генетического разнообразия может привести к потере ценных свойств и особенностей генофондных популяций. Поддержание в жизнеспособном состоянии малочисленных генофондных популяций рыб требует глубокого понимания генетических процессов в таких популяциях [3]. Обеспечение необходимого уровня разнообразия способствует эволюционной устойчивости системы, сохраняя при этом определенную вариабельность. Достичь такого баланса можно, только учитывая одновременно множество генетических локусов в геноме. Биотехнологический мониторинг генетических процессов позволяет своевременно выявить эту проблему и принять соответствующие меры.

Цель исследования заключалась в выявлении особенностей организации генома группы рыб семейства лососевых с точки зрения использования этих данных в селекционной работе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования взяты подвид кумжи – каспийский лосось (Salma trutta caspius), 2 подвида благородного лосося (Salma salar L.) – онежский и балтийский (семга), которые относятся к роду Salmo  семейства лососевых, а также промышленные породы Рофор, Росталь и популяция Золотистой форели. Все образцы получены из Федерального селекционно-генетического центра рыбоводства «Ропша». Каждая группа была представлена выборкой из 9-10 особей. Кровь отбирали в микроцентрифужные пробирки, содержащие 100 мкл 0,5М раствора ЭДТА для предотвращения свертывания крови. Для выделения ДНК достаточно 50 мкл крови от каждой особи. Методика включала следующие этапы:

1. Выделение геномной ДНК из крови осуществляли по общепринятой методике, включающей обработку лизированных ядер эритроцитов протеиназой К и фенолом;
2. Расщепление ДНК проводили рестриктазой HaeIII;
3. Электрофорез проводили в агарозном геле около 2 суток при напряжении 60-70 В;
4. Перенос одноцепочечной ДНК (денатурировали в щелочном растворе) с геля на нейлоновый фильтр под давлением 75-80 ммрт.ст в течении 1 –1,5 час;
5. Прегибридизация при 45С в течении 2 и более час. Она нужна для снижения фона на фильтре в буфере (5SSC – 0,1% SDS – 5 Денхардт);
6. Гибридизация (связывание комплементарных цепей ДНК друг с другом) при  45С в течении 30 мин. делали в таком же растворе, но с включением меченого олигонуклеотида (ГТГ)5. Олигонуклеотид находит комплементарную последовательность ДНК на фильтре и связывается с ней. В качестве нерадиоактивной метки применяли дезоксигенин. Дезоксигенин необходим для выявления мест комплементарного связывания олигонуклеотида с геномной ДНК на фильтре;
7. Детекция (выявление) полос на фильтре проводилась  иммунохимическим методом с применением антитела к дезоксигенину, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Идентификация фрагментов ДНК проводилась по реакции щелочной фосфатазы с красителями NBT и BCIP в местах реакции антитела с дезоксигенином.

Анализ фрагментов ДНК на фильтрах проводили с использованием компьютерной программы RFLPscan™. Она обозначает полосы на фильтре, проводит линии выравнивания по маркерным полосам, рассчитывает массу каждого фрагмента ДНК, сравнивает все полосы на фильтре. В качестве маркера использовали фрагменты ДНК фага лямбда, полученные при расщеплении рестриктазами HindIII и BstEII с мечением по концам дезоксигенином. Расчет коэффициента сходства (BS) и гетерозиготности проводили по программе Gelstats™.

Одним из способов определения генетических расстояний между группами животных является расчет коэффициента сходства (BS). Этот коэффициент показывает долю общих полос между группами животных. Генетические расстояния между группами рыб рассчитывали по формуле Линча [6]. Программа Gelstats™  рассчитывает также гетерозиготность (доля гетерозиготных локусов от общего числа изучаемых локусов в геноме).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследования проводились в два этапа. На первом этапе проводилось сравнение Золотистой форели с породами Рофор и Росталь. Типичная картина распределения фрагментов ДНК на фильтре содержит более 30 фрагментов ДНК (полос).

Анализ частот встречаемости полос на фильтре показал наличие фрагментов ДНК общих для Золотистой форели и исследуемых пород. Обнаружен фрагмент ДНК встречающийся только у Золотистой форели с частотой 0,7 и не встречающийся в породах Рофор и Росталь. Коэффициент сходства внутри пород был значительно выше межпородного, что свидетельствует о генетической дифференцированности популяций (табл. 1). Генетическое расстояние между породами Рофор и Росталь было небольшим (D=0,03), в то же время Золотистая форель генетически значительно отличалась как от рыбы породы Росталь, так и от породы Рофор (D= 0,14 и D=0,10, соответственно).

Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры Золотистой форели  и пород Рофор и Росталь

Р – вероятность встречаемости двух особей в популяции с идентичным распределением всех фрагментов ДНК; BS1 – коэффициент сходства внутри породы; BS2 – коэффициент сходства между породами; D – генетическое расстояние между породами [6].

На втором этапе проводилось сравнение Балтийского, Онежского и Каспийского лососей. На картине фингерпринтинга ДНК имеются полосы, встречающиеся у всех изучаемых видов с частотой 1,0. Есть также фрагменты характерные для Онежского и Балтийского лососей. Коэффициенты сходства между Балтийским и Онежским лососем значительно выше, чем между Каспийским и обоими этими видами (табл. 2). Таким образом, Каспийский лосось генетически сильно удален от группы атлантических лососей, к которым относят Балтийский и Онежский лососи. Эти данные соответствуют географии распространения указанных рыб в природе. Онежское озеро и Балтийское море находятся сравнительно недалеко друг от друга и нельзя исключить возможность скрещивания рыб, обитающих в этих акваториях.

Таблица 2 – Популяционно-генетические параметры популяций Балтийского, Онежского и Каспийского лосося

Было проведено также сравнение генетических профилей между Балтийским, Онежским лососем и промышленной породой лосося Рофор. На картинах фингерпринтинга снова удалось выявить характерные маркерные фрагменты ДНК для каждой из изучаемых групп рыб. Коэффициент сходства между популяциями Балтийского и Онежского лосося выше, чем при сравнении их с форелью породы Рофор (табл. 3). Данные соответствовали результатам, полученным ранее, когда была установлена генетическая близость Онежского и Балтийского лосося. Соответственно, генетическое расстояние между этими видами небольшое. Рофор является промышленной породой, предназначенной для выращивания в различных условиях среды. Изначально порода создавалась с высокой генетической гетерогенностью, обеспечивающей пластичность популяции. Этим она отличается от другой промышленной породы Росталь. В последнем случае целью селекции была не пластичность и приспособленность рыбы к разным условиям, а высокие продуктивные качества в строго контролируемых и оптимальных условиях выращивания. В сравниваемой группе наиболее генетически удаленными оказались Рофор и Онежский лосось (D=0,18).

Таблица 3 – Популяционно-генетические параметры популяций Балтийского, Онежского лосося и породы Рофор

Расчет генетического разнообразия внутри популяций проводился с помощью программы Gelstats™ (табл. 4). Самый высокий уровень гетерозиготности отмечен в популяциях: Каспийского лосося и форели породы Рофор. Самый низкий уровень генетического разнообразия отмечали в популяции Онежского лосося. Данное наблюдение, возможно, объясняется сравнительно небольшими размерами озера, что снижает возможности скрещивания рыбы, обитающих в удаленных местах. Нельзя исключить скрещивание онежских лососей с балтийскими, хотя такая возможность достаточно ограничена вследствие географических преград. Гетерозиготность является хорошим параметром, показывающим генетическое разнообразие популяции. Она коррелирует с уровнем инбридинга, показывающим родственные связи между особями. Низкий уровень гетерозиготности указывает на необходимость привлечения в программах селекции генетического материала со стороны. Это позволяет увеличить гетерозиготность и снизить риск инбредной депрессии, выражающийся в снижении воспроизводительных функций и продуктивных качеств. Известно, что межпородные кроссы у рыб проявляют эффект гетерозиса, который проявляется в повышении жизнеспособности и продуктивных качеств рыбы. Расчет гетерозиготности проводили по трем подходам в соответствии с  программой Gelstats™.

Таблица 4 – Гетерозиготность пород и популяций лосося

Н1 –  средняя гетерозиготность по Stephens [7]; Н2 –  скорректированная гетерозиготность по Stephens [7]; Н3 – гетерозиготность по Jin & Chakraborty [8]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, молекулярно-генетические методы позволяют вскрыть особенности организации генома рыб на популяционном уровне. Полученные данные можно использовать при планировании селекционной работы в рыбоводстве. Например, данные о генетическом родстве позволят прогнозировать эффект гетерозиса, а уровень гетерозиготности является показателем разнообразия популяции и позволяет на научной основе прогнозировать появление негативного влияния инбридинга при разведении рыб в замкнутой популяции.