Целью нашей работы явилось проведение корреляционного анализа между электрической активностью подкорковых структур мозга и поведенческими показателями у крыс при хроническом аудиогенном стрессе.

Методика: предварительно всех животных тестировали в «открытом поле» в течение 5 минут с оценкой основных поведенческих показателей [Е.В. Коплик, 1995]. Хронический аудиогенный стресс моделировали методом сенсорной дезинтеграции по методике Keys ringing («Звон ключей») [А.Л. Крушинский, 2007]. Аудиогенная стимуляция осуществлялась ежедневно в течение 60 мин 20 дней разночастотными стимулами с заданной силой по схеме. Проводили регистрацию электрической активности дорсального гиппокампа, вентромедиального ядра гипоталамуса и латерального ядра миндалины до стресса, на 10 и 20 день сенсорных воздействий [G. Paxinos, 1998]. Рассчитывали энергию декомпозиционных уровней вейвлет-спектра (D1 – 50-100 Гц, D2 – 25-50 Гц, D3 – 12.5-25 Гц, D4 – 6.25-12.5 Гц, D5 – 3.125-6.25 Гц, A5 – 0-3.125 Гц). Проводился корреляционный анализ между показателями поведения и значениями энергии декомпозиционных уровней вейвлет-спектра. Достоверность корреляций оценивали по критерию Спирмена (p<0,05).

Результаты: к 10-му дню стресса корреляционные взаимосвязи наблюдались во всех трех изучаемых структурах. В частности, прямая корреляция между латентным периодом выхода в центр и активностью вентромедиального ядра гипоталамуса в D5 диапазоне (r=0,8, р<0,05) и обратная корреляция между этим же показателем и активностью латерального ядра миндалины в D3 диапазоне (r=-0,84, р<0,05). Время груминга находилось в прямой взаимосвязи с активностью дорсального гиппокампа в D3 диапазоне (r=0,78, р<0,05). Количество болюсов прямо зависело от активности вентромедиального ядра гипоталамуса в D2 диапазоне (r=0,79, р<0,05) и обратно от значений D4 диапазона латерального ядра миндалины (r=-0,82, р<0,05). На 20-й день стрессового воздействия исчезли корреляции с латентным периодом выхода в центр и количеством болюсов, но увеличилось количество корреляций с грумингом и латентным периодом первого движения в исследуемых структурах, а корреляция с вертикальной двигательной активностью выявлена только с латеральным ядром миндалины, как и в контроле.

Каждая из анализируемых структур полифункциональна, но с превалированием какой-то одной функции, так миндалевидный комплекс осуществляет мотивационную окраску, гипоталамус – триггерные функции и интеграцию биологически значимого ответа, а гиппокамп – фиксацию программы поведенческого ответа в памяти [С.А.Чепурнов, Н.Е.Чепурнова, 1981; К.В.Судаков, П.Е.Умрюхин, 2010]. В итоге происходит формирование поведенческой программы реагирования на стрессорное воздействие. В контроле отсутствует стрессорный фактор и происходит оценка сенсорной среды, что обусловлено активностью только латерального ядра миндалевидного комплекса. При появлении стрессора в ответную реакцию включаются центральные адаптационные механизмы: вентромедиальное ядро гипоталамуса и дорсальное ядро гиппокампа.

Таким образом, поведенческие показатели коррелируют с электрической активностью лимбических структур мозга в динамике аудиогенного стресса, что свидетельствует об адаптивных процессах у экспериментальных животных.

Актуальной проблемой современной фармацевтической науки является поиск новых эффективных средств для лечения заболеваний нервной системы. Практически все современные препараты вызывают побочные действия и осложнения, кроме того, при длительном применении возможно возникновение лекарственной зависимости [1].

Интерес вызывают препараты, полученные на основе лекарственного растительного сырья, содержащие комплекс биологически активных веществ, имеющие большую терапевтическую широту в сравнении с существующими, обладающие уникальным сочетанием свойств. Седативные препараты растительного происхождения не вызывают миорелаксации, атаксии, сонливости, явления психической и физической зависимости, оказывают регулирующее влияние на ЦНС, усиливают процессы торможения и понижают процессы возбуждения.

Издавна в народной медицине марьянник луговой – Melamyrum pratense – применялся при невралгиях как седативное средство. В настое проявляет нейролептическую и седативную активность [2]. Представляет интерес изучить экстракт м.лугового и близкого ему морфологического вида м.лесного – m. sylvaticum [3 ].

Материалы и методы

Были исследованы экстракты из травы м. лугового и лесного, полученные по запатентованной методике [4].

Экстракты вводили перорально в виде водного раствора. В качестве препарата сравнения использовали настойку валерианы заводского производства. Перед введением экстракты и настойку валерианы упаривали до 1/3 объема для удаления спирта и доводили водой до метки.

Эксперименты выполняли на 40 белых беспородных мышах обоего пола массой 20 – 25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, в соответствии с действующими Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологческих клиник (вивариев). Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 10 дней.

За пять дней до начала эксперимента регистрировали исходные характеристики поведения мышей (контроль), после чего животные были разделены на 4 группы. Измерение поведенческих показателей в каждой из четырех групп животных проводили через 10, 20 и 30 дней после приема препаратов.

Мыши первой (контрольной) группы получали изотонический раствор натрия хлорида в дозе 1 мл/кг, второй и третьей – экстракт м.лесного и м. лугового соответственно в дозе 200 мг/кг, животные четвертой группы получали настойку валерианы в дозе 0.5 мл/кг. Экстракты, настойку валерианы и изотонический раствор натрия хлорида вводили ежедневно в одно и то же время утром в течение месяца.

Активность оценивали в тесте «Открытое поле». Исследование проводили в специальной камере белого цвета, диаметром 34 см и высотой 17 см. Пол камеры разбит на окружности и сектора, расстояния между которыми соизмерим с размерами мышей. За час до тестирования животных помещали в тихое слабо освещенное место, в подготовительный период с животными никаких манипуляций не проводили. Во время тестирования животное помещали на один из периферийных квадратов открытого поля. Исследование проводили до начала эксперимента, а затем каждые 10 дней в течение месяца.

Оценивали влияние экстрактов на горизонтальную активность (по числу выходов животного в центр площадки и переходов по секторам переферии), вертикальную активность (по числу «вертикальных стоек» – вставание мышей на задние лапки), на наличие груминга (количество приближений передних лап ко рту и их облизывание – короткий груминг; чистка передней части морды, тела – длительный груминг) [6].

Статистическую обработку данных фармакологического эксперимента проводили с применением с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2007.

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных показал, экстракты и настойка валерианы достоверно не влияют на периферическую горизонтальную активность (рис. 1), при этом статистически достоверно снижают число выходов животного в центр площадки уже после десятидневного приема (рис. 2). Уменьшение числа выходов в центр площадки говорит об угнетении ориентировочно-исследовательского поведения животных.

Рисунок 1. Периферическая горизонтальная активность

Рисунок 2. Центральная горизонтальная активность

При длительном применении экстрактов марьянников и настойки валерианы снижается вертикальная активность животных (рис. 3). При этом влияние экстракта м.лугового близко к значениям влияния настойки валерианы. Уменьшение числа «вертикальных стоек» у животных под влиянием экстракционных лекарственных форм свидетельствует о наличии у них седативной активности. На фоне действия настойки валерианы происходит плавное снижение общей двигательной активности.

Рисунок 3. Вертикальная активность

После тридцатидневного приема препратов наблюдается снижение общей двигательной активности подопытных животных (рис. 4). Под влиянием экстрактов изменение активности происходит скачкообразно в течение 30 дней.

Рисунок 3: Вертикальная активность

Рисунок 4. Общая двигательная активность в процентах

Уже после 10 дней пирема препаратов происходит значительное увеличение актов груминга (рис. 5). Под влиянием экстрактов марьянников процент актов груминга значительно выше, чем под влиянием настойки валерианы. Максимальное увеличение происходит на фоне приема экстракта м.лугового. Увеличение числа актов груминга свидетельствует об уменьшении тревожности.

Рисунок 5. Динамика актов груминга в процентах

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что экстракты м.лесного и м.лугового обладают седативной активностью, снижают тревожность, угнетают ориентировочно-исследовательское поведение. Действие экстрактов заметно уже после 10 дней приема и сопоставимо с действием настойки валерианы.

Тест «открытое поле» остается одним их ведущих инструментов оценки индивидуально-типологических особенностей поведения экспериментальных животных [1]. Использование различных модификаций данного метода позволяет оценить широкий спектр психофизиологических функций организма в условиях слабого стресса [2, 3].

Выбор поведенческих показателей, используемых в данном тесте, зависит от задач исследования, опыта экспериментатора, а также возможностей регистрирующей аппаратуры [1].

Определение прогностической устойчивости крыс к эмоциональному стрессу при помощи теста «открытое поле» является признанным методом в физиологии и патофизиологии стресса [4]. При помещении в «открытое поле» животное испытывает слабый стресс, следствием чего является изменение поведения. Выявленные особенности поведения  устойчивых и неустойчивых к эмоциональному стрессу животных позволяют выводить коэффициент индивидуальной прогностической устойчивости к стрессу [5, 6]. При этом оценивается суммарное количество выполненных поведенческих актов за все время эксперимента. Оценивая стрессорное поведение как ряд динамически меняющихся системоквантов [7], оценка показателей поведения с учетом времени эксперимента позволит расширить представления об особенностях поведения животных в условиях стресса.

Целью работы явилось выделение пространственно-временных паттернов поведения крыс различной прогностической устойчивостью к стрессу в тесте «открытое поле».

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на 50 белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. в осенне-зимний период. Работа выполнена в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 года) и приказу МЗ РФ от 19.06.2003 № 267.

С целью определения индивидуальной прогностической устойчивости к стрессу животных тестировали в тесте «открытое поле» [8] в арене белого цвета в течение 5 минут. В ходе тестирования проводили видеосъемку, и регистрировали следующие поведенческие показатели: латентный период первого движения, время выхода в центр, количество пересеченных квадратов, количество стоек, продолжительность груминга, продолжительность фризинга и вегетативный показатель – число болюсов. Затем рассчитывался коэффициент индивидуальной устойчивости крыс к эмоциональному стрессу [5] с выделением устойчивых и неустойчивых к эмоциональному стрессу животных. Дополнительно оценивали время выполнения животным тех или иных поведенческих актов с последующей математической обработкой результатов построением пространственно-временного поведенческого паттерна [9].

Результаты

В результате проведенных экспериментов 15 животных были отнесены к группе неустойчивых к эмоциональному стрессу и имели индивидуальный коэффициент (ИК) 0,27-0,70. 17 животных были отнесены к группе устойчивых к эмоциональному стрессу, у которых ИК был равен 1,1-4,0.

18 крыс, не имевших четких закономерностей поведения, были отнесены к амбивалентной группе, и оценка поведенческих паттернов у них не проводилась.   Сформированные паттерны позволяют произвести быструю первоначальную первичную классификацию исследуемых животных, используя визуальную оценку поведения.

а – стресс-неустойчивые животные

б -стресс-устойчивые животные

Рис. 1. Временные паттерны поведения у крыс с различной прогностической устойчивостью к стрессу при тестировании в «открытом поле»

Рис. 2. Пространственные паттерны поведения у крыс с различной прогностической устойчивостью к стрессу при тестировании в «открытом поле»

Поведение животных с низкой прогностической устойчивостью к стрессу характеризовалось длительным периодом исследовательской активности (более 150 сек), поздним выходом в центр, перемещением животного преимущественно по периферии с последующим непродолжительным периодом фризинга и груминга. По мнению ряда авторов, высокая двигательная активность в «открытом поле» может свидетельствовать как о состоянии комфорта, так и о состоянии сильного стресса, принимая характер оборонительной [10, 11]. Оценка значимости данного поведенческого показателя должна проводиться с учетом дополнительных параметров поведения. Поздний выход в центр отражает отрицательные эмоции животного, т.к. связан со страхом открытого пространства [12]. Преобладание груминга и фризинга во второй половине эксперимента может быть связано с состоянием внутренней тревоги и страха [13, 14]. Таким образом, поведение стресс-неустойчивых животных характеризуется высокой оборонительной активностью вследствие повышенной отрицательной эмоциональности и тревожности.

Особенностью поведения стресс-устойчивых животных являлся очень длительный период исследовательской активности, который составил около 200-250 сек. При этом у животных данной группы после раннего выхода в центр наблюдались повторные передвижения в направлении центральной части арены, так и непосредственно в центре экспериментальной установки. Устойчивые к стрессу крысы отличались активной горизонтальной, а также вертикальной исследовательской активностью на всей площади арены, включая центральную часть. Принимая во внимание низкий уровень груминговой активности, а, следовательно, низкую тревожность [13], и ранний выход в центр, который может свидетельствовать о положительной эмоциональности [12], выраженную исследовательскую активность можно характеризовать как двигательную активность комфорта.

Таким образом, при тестировании в «открытом поле» у животных с различной прогностической устойчивостью к стрессу после первичной оценки экспериментальной установки формируются специфические пространственно-временные паттерны поведения, которые отражают преобладание тех или иных мотиваций у животных в условиях эмоционального стресса.