Цель наших исследований заключалась в подтверждении генетической близости четырех пород коз и сравнении двух популяций одной породы, разводимых продолжительное время в разных странах.

Методика

В качестве молекулярного маркера использовали меченый дезоксигенином олигонуклеотид (ГТГ)5. ДНК выделяли из крови коз фенольно-детергентным способом. Объектом исследования служили образцы ДНК, выделенной из крови 75 коз 4 пород: Тогенбургер, Белая немецкая, Бурая немецкая и Тюрингская лесная. Последняя относится к числу малочисленных генофондных пород и включена в немецкий национальный реестр генофондных пород в соответствии с европейской программой сохранения биоразнообразия (Council Regulation – ЕЕС No 2078/92). Тогенбургеры представлены немецкой популяцией и популяцией из Швейцарии. ДНК расщепляли рестриктазой НаеШ, полученные фрагменты ДНК разделяли по размеру в агарозном геле, а затем переносили на нейлоновый фильтр. В ходе реакции молекулярной гибридизации меченый олигонуклеотид избирательно связывался с некоторыми фрагментами ДНК. Данные места на фильтре становились видимыми в виде полос (фрагменты ДНК) после проведения иммунохимической реакции с использованием цветных красителей. Методические детали были изложены ранее [4; 5]. Каждое животное характеризуется определенным набором полос (ДНК-фингерпринт) и отличается от других особей. Подсчитывается частота встречаемости одного и того же фрагмента у разных особей внутри популяции и между популяциями. Анализ проводился с использованием компьютерной программы RFLPscan, которая позволяет объективно определить положение фрагментов ДНК у каждого животного. Расчеты частот встречаемости фрагментов ДНК и другие популяционно-генетические параметры рассчитывали с использованием программы Gelstats [8]. Данная программа рассчитывает значительное число популяционно-генетических параметров, таких как частоты аллелей, коэффициенты сходства в популяциях животных и между популяциями, значения средней гетерозиготности по всем выявляемым фрагментам ДНК, подразделенность популяции на субпопуляции и т.д. Используя значения коэффициентов сходства, рассчитывали индекс различия между популяциями.

Результаты

Интересной особенностью полученных фингерпринтов у коз, в отличие от всех ранее изученных нами видов животных, было наличие очень интенсивно проявляющегося фрагмента ДНК у всех особей в районе длин фрагментов 8400 пар оснований ДНК. Помимо этого мономорфного фрагмента имелось еще несколько фрагментов ДНК‚ которые встречались с высокой частотой, доходящей до значений 0,9. Эти фрагменты оказали существенное влияние на конечные результаты при расчете популяционно-генетических параметров. Например, коэффициенты сходства (КС) внутри пород (таблица 1) оказались довольно высокими (при сравнении с данными для других видов животных).

Сравнение пород проводили попарно на отдельных фильтрах. Это необходимо для нивелирования различной интенсивности проявления фрагментов ДНК в отдельных экспериментах. Поэтому значения КС для одной и той же породы (популяции) на разных фильтрах могут несколько отличаться (таблица 1). Генофондная порода Тюрингская лесная во многих случаях при попарном сравнении с другими породами показывала повышенные значения КС, что говорит о сужении генетического разнообразия в этой породе (значения КС варьировали на разных фильтрах от 0,48 до 0,58). Особняком стояла популяция Тоггенбургеров, которая содержится изолированно на протяжении длительного времени в Швейцарии. В этой популяции коэффициент сходства был выше и достигал значений 0,61 (таблица 1). Длительное разведение в «себе» популяции швейцарских Тоггенбургеров привело к накоплению генетических различий с намецкими Тоггенбургерами. Тюрингская лесная порода характеризовалась пониженными значениями КС при сравнении с другими породами, что свидетельствует об определенном генетическом удалении данной породы от остальных пород. Генетически наиболее близкими явялются Белая и Бурая немецкие породы коз с индексом различия всего 0,005 (таблица 1).

Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры в популяциях коз четырех пород

ТЛ – Тюрингская лесная, ТГ – Тоггенбургер, ТГшв – Тоггенбургер, популяция из Швейцарии, БН – Белая немецкая, БуН – Бурая немецкая. КС – коэффициент сходства. * Р<0,05 (сравнение КС внутри и между популяциями).

Прямым подтверждением сужения генетического разнообразия в швейцарской популяции Тоггенбургеров и генофондной породы Тюрингская лесная являются относительно низкие значения гетерозиготности – 0,40 и 0,46, соответственно (таблица 2). Данный показатель у Бурой немецкой породы достигал значения 0,59. Несмотря на то, что в швейцарской популяции Тоггенбургеров выявляется наибольшее число локусов – 8,36, гетерозиготность находится на низком уровне, так как отмечается малое число аллелей на один локус – 3,23 (таблица 2).

Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость изученных пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.

Таблица 2 – Внутрипопуляционный генетические параметры в популяциях коз

*P – вероятность того, что две особи из популции будут иметь одинаковое распределение фрагментов ДНК на фильтре.

Таким образом, наши исследования подтвердили генетическую близость пород коз и, на примере породы Тоггенбургер, указали на возможность генетической дивергенции популяций коз одной породы при разведении животных в различных местах.

Методика

Основным методом исследования был молекулярно-генетический подход, основанный на использовании меченого дезоксигенином зонда (ГТГ)5. Данный зонд выявляет полиморфные участки в геноме сравниваемых особей. Геномную ДНК овец выделяли стандартным методом с использованием протеиназы К и фенола. Очищенную ДНК растворяли в буфере ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). В начале исследований оказалось, что получение фингерпринтов на геномной ДНК овец сопряжено с рядом трудностей, которые необходимо было преодолеть. Прежде всего, нужно было найти оптимальное сочетание фермента рестрикции, геномного зонда, условий гибридизации, отмывок фильтров, детекции сигнала. Сравнение ряда ферментов, узнающих 4 пары оснований (такие ферменты рестрикции наиболее подходят для получения фингерпринтов) показало, что наилучшим является НаеIII. Этот фермент характеризуется стабильностью, сравнительно устойчив к примесям в реакционной смеси и давал несколько лучшее разрешение, чем, например HinfI  и AluI. В противоположность HinfI, выбранная нами рестриктаза никогда не выявляла дополнительных неспецифических полос (звездная активность). Вкратце, методика сводилась к следующим стадиям: расщепление ДНК ферментом НаеIII, электрофорез в 0,8% агарозном геле при напряжении 60В в течение 48 часов, перенос фрагментов ДНК на нейлоновый фильтр в приборе вакуумного перенеса, гибридизация ДНК на фильтре с меченым зондом (ГТГ)5, детекция мест связывания зонда на фильтре и использованием антитела к дезоксигенину.

Были изучены 10 популяций овец, принадлежащих четырем породам, разводимым в Германии. Количество особей в каждой группе колебалось от 10 до 30. Известно, эта страна располагает уникальной коллекцией локальных пород овец с четкой регистрацией происхождения и процесса разведения. Одной из таких пород является порода Лайнешаф (названная по имени реки, протекающей большей частью в земле Нижняя Саксония). Имеется два типа животных этой породы: новый и старый. Животные старого типа были в свое время вывезены в Польшу, а затем снова импортированы в страну. Редкие сохраняемые породы животных разводятся, в основном, на частных фермах. Фермеры на каждую голову генофондных животных получают дотацию из федерального и земельного бюджета и поэтому с желанием ведут такое хозяйство. Старый тип овец Лайнешаф разводится в трех популяциях. В нашем случае, это популяции VII, VIII и IX. Каждая из этих групп животных содержится изолированно у разных фермеров. Животные нового типа также содержатся на изолированных фермах и распределены в популяциях  I, II, III и IV. Согласно сохранившимся старым записям, есть некоторые свидетельства генетического влияния на некоторые из этих популяций других пород, обозначенных в наших исследованиях как популяции V, VI и X. Задачей работы было подтвердить или опровергнуть данные о происхождении животных.

Результаты

Используя полученные данные по распределению полос (фрагментов ДНК) в разных популяциях животных, можно рассчитать коэффициенты сходства (доля общих полос у сравниваемых животных) во всех комбинациях овец. Таблица 1 демонстрирует межпопуляционные коэффициенты сходства у старого и нового типа овец Лайнешаф, длинношерстных Мериносов, Остфризской молочной пород и Текселей.

Таблица 1 – Коэффициенты сходства в популяциях овец пород Лайнешаф, длинношерстных Мериносов, Остфризской молочной пород и Текселей по данным картин фингерпринтинга

* -  номера популяций в данном исследовании обозначены согласно разделу «Методика»

Наиболее высокий коэффициент сходства обнаруживался в двух популяциях породы Лайнешаф (популяции I и III). При сравнении групп животных породы Лайнешаф с Остфризскими молочными овцами были получены значения BS в диапазоне 0,23 – 0,39, с овцами Тексель – 0,1 – 0,26. Длинношерстные Мериносы показали высокое сходство с одной из популяций Лайнешаф старого типа, содержащейся в районе Айхсфельда  (BS = 0,55). Нужно отметить, что животные этой группы содержатся без ведения племенной книги и в процессе разведения скрещивались с длинношерстными Мериносами. Мы не наблюдали высокого сходства между популяциями животных породы Лайнешаф. Так, в группах овец нового и старого типов коэффициент сходства колебался от 0,20 до 0,37. Исключением была только одна пара с особенно высоким генетическим сходством (популяции нового типа I и III). Генетическая дивергенция наиболее выражена в паре Тексель – популяция IX старого типа овец Лайнешаф (низкий коэффициент сходства равный 0,1).

В качестве меры генетической дивергенции между группами животных мы использовали генетическое расстояние по Роджерсу. Полученный цифровой материал по генетической дивергенции суммирован в таблице 2.

Таблица 2 – Генетическое расстояние по Роджерсу в популяциях овец

Таблица показывает, что в ряде случаев отмечается согласование результатов анализа с данными таблицы 1, однако в случае с популяциями I и III нет прямой связи между данными этих таблиц. Расчет генетического расстояния по Роджерсу предполагает вычисление частот встречаемости всех полос на фильтрах, в то время, как расчет коэффициента сходства основан на учете лишь общих полос и технически осуществляется проще. Сравнение данных таблиц 1 и 2 с известными фактами выведения и разведения пород и популяций овец указывает на большую надежность измерения генетической дивергенции по данным коэффициента сходства, чем по генетическим расстояниям по Роджерсу. Во всех последующих экспериментах мы применяли именно этот подход.

В связи с тем, что при расчете генетических расстояний мы использовали данные по частотам встречаемости полос, эти же данные было легко применить и для выяснения внутрипопуляционной генетической вариабельности (гетерозиготность) в популяциях овец. Данные по средней гетерозиготности в популяциях овец содержатся в таблице 3.

Таблица 3 – Внутрипопуляционная генетическая вариабельность (гетерозиготность) в популяциях овец по данным картин фингерпринтинга

Овцы Тексель отличались чрезвычайно низкой средней гетерозиготностью (Н = 0,66) в сравнении с большинством других изученных групп животных. Находящаяся на грани полного исчезновения местная порода Лайнешаф характеризовалась достаточно высоким генетическим полиморфизмом, отражающем высокие значения средней гетерозиготности почти во всех изученных популяциях (за исключением популяции I овец нового типа с уровнем гетерозиготности всего 0,67).

В последние годы в мировой селекции животных и растений происходят кардинальные изменения, связанные с внедрением и интенсификацией геномной технологии. Она уже освоена и успешно применяется в селекционных программах большинства стран, в том числе и России. Изучение генетической изменчивости популяций в настоящее время широко используется для повышения эффективности селекции, выяснения истории формирования существующих пород и планирования работы в генофондных популяциях [1; 2; 3]. Накопление фундаментальных знаний о породообразовательных процессах способствует дальнейшему совершенствованию существующих пород рыб и применению эффективных приемов для  ускорения темпов селекции. Исследование полиморфизма мини- и микросателлитных ДНК дает возможность надежно и точно определять генетическое разнообразие внутри и между популяциями [4; 5;]. Снижение генетического разнообразия может привести к потере ценных свойств и особенностей генофондных популяций. Поддержание в жизнеспособном состоянии малочисленных генофондных популяций рыб требует глубокого понимания генетических процессов в таких популяциях [3]. Обеспечение необходимого уровня разнообразия способствует эволюционной устойчивости системы, сохраняя при этом определенную вариабельность. Достичь такого баланса можно, только учитывая одновременно множество генетических локусов в геноме. Биотехнологический мониторинг генетических процессов позволяет своевременно выявить эту проблему и принять соответствующие меры.

Цель исследования заключалась в выявлении особенностей организации генома группы рыб семейства лососевых с точки зрения использования этих данных в селекционной работе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования взяты подвид кумжи – каспийский лосось (Salma trutta caspius), 2 подвида благородного лосося (Salma salar L.) – онежский и балтийский (семга), которые относятся к роду Salmo  семейства лососевых, а также промышленные породы Рофор, Росталь и популяция Золотистой форели. Все образцы получены из Федерального селекционно-генетического центра рыбоводства «Ропша». Каждая группа была представлена выборкой из 9-10 особей. Кровь отбирали в микроцентрифужные пробирки, содержащие 100 мкл 0,5М раствора ЭДТА для предотвращения свертывания крови. Для выделения ДНК достаточно 50 мкл крови от каждой особи. Методика включала следующие этапы:

1. Выделение геномной ДНК из крови осуществляли по общепринятой методике, включающей обработку лизированных ядер эритроцитов протеиназой К и фенолом;
2. Расщепление ДНК проводили рестриктазой HaeIII;
3. Электрофорез проводили в агарозном геле около 2 суток при напряжении 60-70 В;
4. Перенос одноцепочечной ДНК (денатурировали в щелочном растворе) с геля на нейлоновый фильтр под давлением 75-80 ммрт.ст в течении 1 –1,5 час;
5. Прегибридизация при 45С в течении 2 и более час. Она нужна для снижения фона на фильтре в буфере (5SSC – 0,1% SDS – 5 Денхардт);
6. Гибридизация (связывание комплементарных цепей ДНК друг с другом) при  45С в течении 30 мин. делали в таком же растворе, но с включением меченого олигонуклеотида (ГТГ)5. Олигонуклеотид находит комплементарную последовательность ДНК на фильтре и связывается с ней. В качестве нерадиоактивной метки применяли дезоксигенин. Дезоксигенин необходим для выявления мест комплементарного связывания олигонуклеотида с геномной ДНК на фильтре;
7. Детекция (выявление) полос на фильтре проводилась  иммунохимическим методом с применением антитела к дезоксигенину, конъюгированного со щелочной фосфатазой. Идентификация фрагментов ДНК проводилась по реакции щелочной фосфатазы с красителями NBT и BCIP в местах реакции антитела с дезоксигенином.

Анализ фрагментов ДНК на фильтрах проводили с использованием компьютерной программы RFLPscan™. Она обозначает полосы на фильтре, проводит линии выравнивания по маркерным полосам, рассчитывает массу каждого фрагмента ДНК, сравнивает все полосы на фильтре. В качестве маркера использовали фрагменты ДНК фага лямбда, полученные при расщеплении рестриктазами HindIII и BstEII с мечением по концам дезоксигенином. Расчет коэффициента сходства (BS) и гетерозиготности проводили по программе Gelstats™.

Одним из способов определения генетических расстояний между группами животных является расчет коэффициента сходства (BS). Этот коэффициент показывает долю общих полос между группами животных. Генетические расстояния между группами рыб рассчитывали по формуле Линча [6]. Программа Gelstats™  рассчитывает также гетерозиготность (доля гетерозиготных локусов от общего числа изучаемых локусов в геноме).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследования проводились в два этапа. На первом этапе проводилось сравнение Золотистой форели с породами Рофор и Росталь. Типичная картина распределения фрагментов ДНК на фильтре содержит более 30 фрагментов ДНК (полос).

Анализ частот встречаемости полос на фильтре показал наличие фрагментов ДНК общих для Золотистой форели и исследуемых пород. Обнаружен фрагмент ДНК встречающийся только у Золотистой форели с частотой 0,7 и не встречающийся в породах Рофор и Росталь. Коэффициент сходства внутри пород был значительно выше межпородного, что свидетельствует о генетической дифференцированности популяций (табл. 1). Генетическое расстояние между породами Рофор и Росталь было небольшим (D=0,03), в то же время Золотистая форель генетически значительно отличалась как от рыбы породы Росталь, так и от породы Рофор (D= 0,14 и D=0,10, соответственно).

Таблица 1 – Популяционно-генетические параметры Золотистой форели  и пород Рофор и Росталь

Р – вероятность встречаемости двух особей в популяции с идентичным распределением всех фрагментов ДНК; BS1 – коэффициент сходства внутри породы; BS2 – коэффициент сходства между породами; D – генетическое расстояние между породами [6].

На втором этапе проводилось сравнение Балтийского, Онежского и Каспийского лососей. На картине фингерпринтинга ДНК имеются полосы, встречающиеся у всех изучаемых видов с частотой 1,0. Есть также фрагменты характерные для Онежского и Балтийского лососей. Коэффициенты сходства между Балтийским и Онежским лососем значительно выше, чем между Каспийским и обоими этими видами (табл. 2). Таким образом, Каспийский лосось генетически сильно удален от группы атлантических лососей, к которым относят Балтийский и Онежский лососи. Эти данные соответствуют географии распространения указанных рыб в природе. Онежское озеро и Балтийское море находятся сравнительно недалеко друг от друга и нельзя исключить возможность скрещивания рыб, обитающих в этих акваториях.

Таблица 2 – Популяционно-генетические параметры популяций Балтийского, Онежского и Каспийского лосося

Было проведено также сравнение генетических профилей между Балтийским, Онежским лососем и промышленной породой лосося Рофор. На картинах фингерпринтинга снова удалось выявить характерные маркерные фрагменты ДНК для каждой из изучаемых групп рыб. Коэффициент сходства между популяциями Балтийского и Онежского лосося выше, чем при сравнении их с форелью породы Рофор (табл. 3). Данные соответствовали результатам, полученным ранее, когда была установлена генетическая близость Онежского и Балтийского лосося. Соответственно, генетическое расстояние между этими видами небольшое. Рофор является промышленной породой, предназначенной для выращивания в различных условиях среды. Изначально порода создавалась с высокой генетической гетерогенностью, обеспечивающей пластичность популяции. Этим она отличается от другой промышленной породы Росталь. В последнем случае целью селекции была не пластичность и приспособленность рыбы к разным условиям, а высокие продуктивные качества в строго контролируемых и оптимальных условиях выращивания. В сравниваемой группе наиболее генетически удаленными оказались Рофор и Онежский лосось (D=0,18).

Таблица 3 – Популяционно-генетические параметры популяций Балтийского, Онежского лосося и породы Рофор

Расчет генетического разнообразия внутри популяций проводился с помощью программы Gelstats™ (табл. 4). Самый высокий уровень гетерозиготности отмечен в популяциях: Каспийского лосося и форели породы Рофор. Самый низкий уровень генетического разнообразия отмечали в популяции Онежского лосося. Данное наблюдение, возможно, объясняется сравнительно небольшими размерами озера, что снижает возможности скрещивания рыбы, обитающих в удаленных местах. Нельзя исключить скрещивание онежских лососей с балтийскими, хотя такая возможность достаточно ограничена вследствие географических преград. Гетерозиготность является хорошим параметром, показывающим генетическое разнообразие популяции. Она коррелирует с уровнем инбридинга, показывающим родственные связи между особями. Низкий уровень гетерозиготности указывает на необходимость привлечения в программах селекции генетического материала со стороны. Это позволяет увеличить гетерозиготность и снизить риск инбредной депрессии, выражающийся в снижении воспроизводительных функций и продуктивных качеств. Известно, что межпородные кроссы у рыб проявляют эффект гетерозиса, который проявляется в повышении жизнеспособности и продуктивных качеств рыбы. Расчет гетерозиготности проводили по трем подходам в соответствии с  программой Gelstats™.

Таблица 4 – Гетерозиготность пород и популяций лосося

Н1 –  средняя гетерозиготность по Stephens [7]; Н2 –  скорректированная гетерозиготность по Stephens [7]; Н3 – гетерозиготность по Jin & Chakraborty [8]

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, молекулярно-генетические методы позволяют вскрыть особенности организации генома рыб на популяционном уровне. Полученные данные можно использовать при планировании селекционной работы в рыбоводстве. Например, данные о генетическом родстве позволят прогнозировать эффект гетерозиса, а уровень гетерозиготности является показателем разнообразия популяции и позволяет на научной основе прогнозировать появление негативного влияния инбридинга при разведении рыб в замкнутой популяции.