Барбарис обыкновенный – колючий кустарник высотой до 2,5 м с хорошо развитой корневой системой.На стеблях находятся множество трех- пятираздельных колючек,  стволы покрыты сероватой корой. Листья эллиптические, длиной до 4 см, с мелкопильчатым краем пластинки, короткими черешками, плотные. Цветки небольшие, ярко-желтые, в соцветиях длиной до 6 см. , с двойным шестичленным околоцветниом,  чашелистики отличаются от лепестков по внешнему виду. Плоды – продолговатые, ярко-красные ягоды длиной до 12 мм. Цветет в мае-июне. Плоды созревают в августе-сентябре и остаются на кустах до зимы. Берберин  содержится в корнях барбариса обыкновенного. По литературным данным  в Berberis vulgaris, с  содержанием  до 0,5- 1,5%, а так же  во многих растениях семейств лютиковых (Ranunculaceae), барбарисовых (Berberidaceae), луносемянниковых (Menispermaceae), рутовых (Rutaceae) и др . Биологическое действие: Снижает артериальное давление, ослабляет сердечную деятельность, вызывает сокращение гладкой мускулатуры матки и кишечника, усиливает отделение желчи.[ 1-3 ].

В Грузии барбарис обыкновенный встречается в лесах средней части гор, по лесным опушкам, по берегам рек. Барбарис распространён почти во всех районах Грузии, кроме Джавахетии и Месхетии.

При подборе системы для хроматографирования наиболее эффективным оказалось разделение в тонком закрепленном слое силикагеля в системе н-бутанол-ледяная уксусная кислота-во­да (10:1:3). При этом на хроматограмме наблюдается 4 резко очерченных пятна, одно из которых (Rf=0,43) находится на уровне стандартного образца берберина. Идентичность на­ходящегося в этом пятне вещества с берберином была доказа­на методами многократного хроматографирования, добавок берберина на стартовую полосу, и ИК – спектрофотометрированием элюата. Для элюации из пятна берберина были использованы, как органические растворители, так и растворы минеральных кислот. При этом оказалось, что наиболее перспективно при­менение 10%раствора уксусной кислоты, что позволяет поднять коэффициент элюации до 96%. Благодаря тому, что получаемые при этом элюаты окрашены в слабожелтый цвет, возникает во­зможность их непосредственного фотометрирования, При опреде­лении индукционного периода выяснилось, что получаемые элюаты сохраняют стабильную окраску в течение 48 часов.

Хроматографирование проводилось в тонком слое на сте­клянных пластинках размером 9 х 13см. В качестве носителя использовался силикагель марки ЛСЛ₂₅₄ или КСК с добавкой гипса и воды (соотношение силикагель-гипс-вода = 4,5:0,5:12). Пластинки сушатся на воздухе, а затем активируются при 100-110⁰ в течение 30 минут.

Построение градуировочного графика.

А. Для приготовления стандартного раствора О,5г (т.н.) 2-ды перекристализированного из спирта фармакопейного берберина бисульфата растворяется в метаноле в 100мл мерной колбе.

Микропипеткой определенные объемы данного раствора на­носятся на пластинку с целью получения концентраций при элюации в пределах 0,01-0,5мг%.

Б. После хроматографирования и высушивания пластинки на воздухе участки сорбента желтого цвета, содержащие берберин, соскабливаются с пластинки в 50мл стаканчики и алка­лоид элюируется по порциями по 8-10мл 8 раз (до получения бесцветного извлечения) 10%-ой уксусной кислотой. Полученные уксусно-кислотные извлечения фильтруются через двойной бумажный фильтр в 100мл мерные колбы, после чего объем раствора доводится 10%-ой уксусной кислотой до метки. Раство­ры спектофотометрируются при длине волны l=345нм  по отношению к раствору 10%-ой уксусной кислоте.

Закон Бугера-Лаьерта-Бера выполняется в пределах 0,01-0, 3мг%.

Определение содержания берберина в сырье.

а) 10г тонкоизмельченных корней барбариса обыкновенного (т.н.) просеянных через сито с диаметром отверстий 1мм, вносятся с колбу с обратным холодильником, куда предварительно зали­вается 200мл 95°спирта,содержащего 5% уксусной кислоты. Смесь выдерживается при температуре кипения в течение 2-3 часов.Полнота извлечения контролируется качественными реакциями  и хроматографией в тонком слое последующих сгущеных извлечений. Полученный спиртовый раствор суммы алкалоидов фильтруется через бумажный фильтр и сгущается под вакуумом. Из сгу­щенного спиртового экстракта  отбирается 0,05-0,2 мл раствора ( взависимости от концентрации) и наносится на пластинку , на паралелную полосу наносится I капля 1% стандартногораствора берберина бисульфата. После храматографирования и высушивания пластинки на воздухе, от­мечается пятно, расположенное на уровне стандартного обра­зца берберина. После чего ход анализа идентичен описанному при построении градировочного графика берберина (часть Б). Содержание берберина в сырье в процентах (X₁)- опреде­ляется по формуле:

                                            (1)

А – навеска сырья) мг;

V₁ - объем полученного сгущенного спиртового раствора, нанесен­ного на пластинку, мл;

V₂  -объем полученного сгущенного спиртового экстракта, мл;

В – количество берберина, соответствующее замеренной оптиче­ской плотности по градуировичному графику мг%.

б) Содержание берберина в сырье можно определять и без предварительного построения градировочного графика бербе­рина. В этом случае на хромотографическую пластинку рядом с исследуемым  сгущеным раствором наносится 0,1мл 0,1% раствора ста­ндартного образца берберина в метаноле, приготовленного ана­логично раствору для построения градуировочного графика. После хроматогрефирования пластинки, в стаканчики элюируются пятна берберина  исследуемого раствора и  стандартного образца. Далее поступают аналогично построению градуировочному графику – часть Б, измеряя экстинцию раствора исследуемо­го и стандартного образца. В этом случае содержание бербери­на в сырье рассчитывают по формуле:

 , где                           (2)

А – навеска сырья в г;

V₁- объем сгущенного спиртового раствора суммы алкалоидов, мл;

V₂- количество сгущенного спиртового раствора, нанесенного

на пластинку для хроматографирования_s мл;

V₃- объем уксусно-кислых извлечений, полученных при элюации берберина с сорбента, мл; (исслед. раствор);

С_ст - концентрация раствора стандартного образца берберина в уксусно-кислотных извлечениях, г/мл;

Д_ст- оптическая плотность раствора стандартного образца берберина;

Д_х - оптическая плотность раствора.

Определение содержания берберина в экстрактах

0,2 мл  подготовленного спиртового кислого извлечения либо спиртового экстракта из корней барбариса обыкновенного наносится на пластинку для хроматографирования. Дальнейший ход работы аналогичен работе при построении градировочного графика, часть Б.

Расчет процентного содержания берберина в экстракте проводится по формуле

, где                              (3)

V₁   - объем исследуемого раствора, нанесенного на пластинку, мл;

V₂  - объем уксусно-кислотных извлечений, полученных после элюации берберина с пластинки, мл (исслед. раствор);

С_ст - концентрация раствора стандартного образца берберина в уксуснокислотных извлечениях , г/мл;

Д_ст - оптическая плотность стандартного раствора;

Д_х - оптическая плотность исследуемого раствора.

Приводим данные по валидационным характеристикам.

Воспризводимость метода (метрологическая характеристика)  определения берберина в сырье полупродуктах производства, в экстрактах показала, что точность метода при проведении в 1-но кратной  повторности с Р= 90% составляет +6,35%.

Показатели  правильности определения  в одной повторности соответствуют  этим  данным (таблица1).

Правильность определения

Таблица1

Линейность определения сохраняется практически в тех же пределах, как указано выще. Определение сходимости результатов анализа показало ощибку в пределах  3,4- 5,3%,(отн.). Специфичность методак изучалась при добавление алкалоидов колхамин и колхицин  в количестве   0,2%, относительное отклонение находилось в пределах 3,5-4,9%. Промежуточная претензиозность( 2 аналитика , 6 дней) показала относительное отклонение в пределах 3,8-4,9%.

Содержание берберина в корнях растения  в зависимости  от времени и места сбора колеблется в пределах 0,6- 1,2% .