Тиреоидные гормоны (ТГ), как известно, являются одним из важнейших основных фак­то­­ров регуляции обеспечения нормального развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС) жи­­вого организма. ТГ осуществляется ряд жизненно важных процес­сов, таких как регу­ля­ция ά₁ – адренорецепторов в коре больших полушарий (КБП) головного мозга (ГМ) крыс. Дан­ными ис­сле­до­ваниями доказано, что тиреоидные гормоны регулируют количество ά₁ – адре­норецеп­то­ров на мембране нейронов КБП ГМ крысы, не меняя их связывающей спо­соб­ности (1). Известны исследования связи ТГ с активностью фосфо­ли­па­зы митохондрий печени крыс с экспериментальным гипертиреозом, показавшие, что одно­крат­­ная инъекция тироксина спо­собствует увеличению активации митохондриальной фосфо­ли­­пазы (2). Также ТГ осу­щест­­вляется регуляция транспорта пирувата в митохондриях путем стимуляции глюкогенеза на уровне данного транспорта пирувата из ци­­тозоля в митохондрии, следствием чего является снижение чувствительности к инсулину и уве­личение активности инсулинзависимого цито­плаз­матического регулятора в органах – ми­ше­­­нях инсу­ли­на (3). Известны работы по иссле­до­ванию регуляции ТГ ре­цепторов для факторов роста, по­доб­ных инсулину (4); детально ис­сле­дован цикл дейодиза­ции тироксина (Т4) и три­йод­ти­ро­ни­на (Т3) в ГМ крыс (5); влияние Т4 на концент­ра­­цию цереброспинальной жидкости (6). В литературе имеются заслуживающие вни­мания дан­­ные относительно влияния ТГ на состав фос­фолипидов тка­ни лёгкого и сур­фактанта у крыс. В данных исследованиях у гипо­ти­рео­ид­ных крыс методом тонкослой­ной хроматографии выявили значительное сни­же­ние содер­жа­ния общих липидов, общих фо­с­­фо­ли­пидов, фосфатидилэтаноламина, фосфати­д­дил­холина в ткани легкого и общих фос­фо­ли­пидов и фосфатидилэтаноламина в сурфактанте лёгких. У гипертиреоидных крыс обна­ру­жи­ли значительное повышение вышеуказанных по­ка­зате­лей, после систематического шес­ти­дневного введения Т4 в определенных дозировках (7). Имеются данные об увели­че­нии Т4 концентрации фактора роста нервов в головном мозге взрослой мыши, сог­лас­но которым Т4 приводил к значительному возрастанию концентрации фактора рос­та нервов в церебральной коре, мозжечке и стволе мозга (8). Несомненный науч­ный ин­те­рес пред­ставляют данные о влиянии гипо – и гиперпродукции гормонов щитовидной железы (ЩЖ) на мор­­фологическое и функциональное развитие переднего мозга, мозжечка, пе­ри­фе­ри­чес­­кой нерв­ной системы, рост нейритов в культуре ткани, формировании синапсов, мик­ро­тру­бо­­чек, раз­витие астро – и олигодендроглии, шванновских клеток и миелинизации, а также роль ТГ в становлении энергетического, белкового и нуклеопротеидного мета­бо­лизма в ЦНС и формировании систем “нейромедиаторы – рецеп­то­ры” (9). В литературе имеются дан­ные относительно применения эк­зо­ген­ных ТГ, приводящих к улучшению функцио­наль­но­го восстановле­ния после травмы пери­фе­­ри­чес­кой нервной системы и ЦНС (10). Другие на­уч­ные иссле­до­ва­ния сви­де­тель­ст­ву­ют о небольшом улучшении функционального вос­ста­нов­ле­ния в пов­­реждённом спинном мозге (СМ) крыс при действии экзогенного Т3 в течение двух недель после спин­но­моз­­гового повреждения (11, 12). На животных с латеральной гемисекцией (ЛГМС) СМ и дей­ст­вием Т4 показано быстрое восстановление соматических функ­­ций, соп­ро­вож­да­ю­­щееся более выраженной гипер­тро­фией нейронов и разрастанием нерв­­­­ных волокон, а так­же наличием слабо выраженных дис­тро­фи­чес­ких и рубцовых изме­не­ний в поврежденной об­лас­ти СМ (13). Нашими исследованиями на кры­сах, под­вер­­женных  ЛГМС и действию Т4, и с регистрацией электрической актив­но­сти спин­номозговых потен­циа­лов были получены предварительные данные, указывающие на акти­вирую­щее действие гормона ЩЖ (14). В наших последующих исследова­ни­ях была под­робно изу­че­на роль Т4 в изменении электри­чес­кой активности ин­тер­ней­ронов и мото­ней­ро­нов пов­реждённого СМ крыс и был пред­став­лен под­роб­ный анализ данных, ка­саю­­щих­­ся влияния Т4 на изменение электрической актив­ности нейронов СМ крыс в нор­ме и при патологии (15).

Известно, что компенсаторные приспособления в повреждённом организме осущест­в­ля­­­ются благодаря сложному синтезу многообразных, взаимодействующих в организме и в осо­беннос­ти в ЦНС процессов, к которым относится в частности регенерация пов­реждённых структур (16). Одним из актуальных вопросов современной физиологии и ме­дицины является вопрос о состоянии восстановительных процессов при повреждениях СМ у млекопитающих при воздействии различных препаратов. Особый интерес пред­став­ляет применение фер­мент­ных препаратов (ФП) при органических повреждениях СМ. Ферментами являются био­ло­ги­чес­кие катализаторы, ускоряющие биологические про­цес­сы внутри клетки. Они представляют собой белки, в молекуле которых имеется один или нес­колько участков для прикрепления субстрата, т. е. вещества, подвергающегося дейст­вию дан­ного фермента. Ферментативная ак­тив­ность в отличие от действия неорганических ка­та­ли­заторов является специфичной, т. е. каждый фермент способен действовать на один опре­де­ленный тип субстрата. Первейшей предпосылкой поставленной нами в проведении по­доб­ного рода исследований – поиск опти­маль­ного средства стимулирующего и благо­прият­ст­ву­ющего росту волокон повреждё­н­ных пу­тей СМ. Основываясь на дан­ном ут­вер­ж­де­нии, нами, учитывая особенности биохи­ми­чес­ких, гистохимических и мор­фо­ло­гических про­цессов поврежденного СМ и ферментных систем, поставили пе­ред собой цель – най­ти препараты и способы воздействий, которые с одной стороны ин­ги­би­ру­ют рост руб­цо­вой ткани, с другой – благо­прият­ствуют и сти­му­ли­ру­ют рост нерв­ных воло­кон с тем, что­бы добиться восстановления проводимости СМ. Выбор фер­мента  ли­дазы (ЛД) в данных сериях научных исследований обусловлен фактом наличия в ка­чес­тве основного компонента соедини­тель­ной ткани гиа­луроновой кислоты (вы­со­ко­мо­ле­ку­ляр­ного полисахарида) входя­щей в состав межткане­во­го и межклеточного вещества, вы­пол­няю­щей роль “цементирую­ще­го” аген­та и играющей важную роль в регуляции тканевой про­ни­­цаемости (17 – 19). ЛД – это фер­ментный пре­па­рат гиалуронидазного действия, синте­зи­рованный в 1958 г. В. А. Ал­ферь­е­вой. Было по­ка­за­но, что в связи с расщеплением гиа­лу­ро­но­вой кислоты соединитель­ной ткани ЛД ак­тив­но тормозиться процесс после­опе­ра­ционного рубцевания, что при­во­дит  к образованию очень тонкого и рыхлого рубца. Этот фер­мент оказывал благотворное дейст­вие при лечении ке­­лоидных рубцов, рубцовом су­же­нии мо­четочника, контрактур, скле­ро­дер­мии и других зат­вер­дений, вызванных развитием сое­ди­ни­тельной ткани. Под влия­ни­ем ЛД гиалуроновая кис­лота, как вне организма, так и в тка­нях организма деполиме­ри­зует­ся и расщепляется. Сна­чала разрушается связь между по­ли­саха­ридной и белковой частью. Сле­ду­ю­­щая фаза – де­полимеризация со снижением вяз­кос­ти, и, наконец, гидролиз с раз­ру­ше­нием глю­козидной связи между кислотой и ацетилглю­ко­за­мином. Фаза депо­ли­ме­ри­за­ции гиа­лу­ро­но­вой кисло­ты сопровождается уменьшением ее вяз­кости, что приводит к уве­ли­че­нию проницаемости тканей и межклеточного вещества, а так­же последующем торможением образования колла­ге­новых волокон.

Известно, что холин (от греч. сholy – жёлчь), гидроокись 2 – оксиэтил­три­ме­тил­ам­мо­ния, [(CH3)3N+CH2CH2OH] OH^-. Бес­цветные кристаллы, хорошо раст­во­римые в воде, эти­­ло­вом спирте, не­раст­во­ри­мые в эфире, бензоле. Холин лег­ко об­­разует соли с силь­ными кис­ло­та­ми, его вод­ные растворы обладают свойст­ва­ми сильных щело­чей. Впервые получен из жёлчи. Ши­роко распространён в живых ор­га­низмах. Осо­бен­­но высоко содержание его в яич­ном желтке, мозге, печени, поч­ках и мышце сер­д­ца. Холин обычно относят к витаминам группы В, хотя животные и микро­ор­га­­­низ­мы способны его синтезировать. Холин входит в состав фос­фо­ли­пи­дов (нап­ри­мер, лецитина, сфингомиелина), служит источником метильных групп в синтезе ме­тио­нина. Из холина в организме животных синтезируется ацетилхолин – один из важ­нейших химических передатчиков нервных импульсов. Холин явля­ет­ся так на­зы­­ваемым липо­троп­ным веществом, предотвращает тяжёлые забо­ле­ва­ния печени, воз­никающие при её жировом перерождении. В медицине для лечения за­болеваний пе­чени применяют хло­рид холина (20 –  22). Его вводят также в состав комби­кор­мов сель­с­ко­хо­зяй­ственных жи­вот­ных. Для аналитических целей используют спо­соб­ность хо­ли­на давать плохо раствори­мые со­ли с фосфорновольфрамовой, пла­ти­но­хло­рис­то­во­до­род­ной и некоторыми другими гетеро­по­­ли­кислотами (23 –  29). Холин является аминоспиртом, хи­мическим веществом близким по своему строению к фос­фа­ти­до­вым кислотам, наи­более прос­той форме фосфолипидов, которые, как из­вест­но, слу­жат главными ком­понен­та­ми биологических мембран (30). От­ли­чи­тельным приз­наком фосфатидовых кислот является наличие остатка фосфорной кис­­лоты, ко­торый об­ра­зует слож­но­эфирную связь с гид­роксильной группой sn – С – З глице­ри­на. Поэ­то­му фос­­­фо­ли­пи­ды по крайней мере в нейтральной области рН не­сут от­ри­­ца­­тельный за­ряд. Наибо­лее простая форма фос­фолипидов, фос­фа­ти­до­вые кис­ло­ты, являются фосфо – мо­но­­эфи­­рами диа­цил­гли­церина. Фосфатидовые кис­лоты – важ­­ней­шие пред­­­­шест­вен­ни­ки в био­синте­зе жи­ров и фосфолипидов. Фос­фа­тидовые кис­лоты мо­­гут быть по­лу­­че­ны из фосфо­гли­церидов с помощью фос­фо­ли­паз. Фосфатидовая кис­лота (ос­та­ток фос­фатидил –) служит исходным веществом для син­теза других фос­фолипидов. Ос­таток фосфор­ной кислоты может образо­вы­вать сложноэфирную связь с гидрок­силь­ными груп­па­ми аминоспиртов (холин, эта­нол­амин или серин) или по­ли­спир­тов (миоинозит) Холин является предшест­вен­ни­ком аце­тилхолина – од­ного из передатчиков нервных импульсов, или ней­ро­ме­ди­а­то­ров (31). Для синтеза  нейроме­ди­атора аце­тил­холина нервная ткань по­лу­ча­ет хо­лин извне, пос­коль­ку он в мозге прак­тически не синтезируется и пос­ту­пает туда из кро­ви через ге­матоэнце­фа­ли­­чес­кий барьер. Часть холина используется для ре­син­те­за ле­цитина и убихинона, дру­гая часть в хо­ли­нергических нейронах – для син­теза аце­­тилхолина. Внут­ри­кле­точ­ное содержа­ние холина в ткани мозга сос­тав­ляет боль­ше 50 %, остальная часть хо­­лина зах­ва­ты­в­а­ется терминалями из си­нап­ти­ческой ще­ли после гидролиза и ис­поль­­зуется пов­тор­но. Захваченный хо­ли­нер­ги­чес­­ки­ми тер­ми­налями холин (60 – 72 %) сразу прев­ра­­ща­ет­ся в аце­тилхолин (32). Био­синтез хо­ли­­на осу­щест­вля­ет­ся пу­тём мети­ли­ро­ва­ния N – диме­тил­ами­­­но­эта­но­ла, син­­тези­ру­е­мо­го из серина (33).

В кор­ре­ги­ро­вании соматических и нейрогенных нарушений невто­ро­с­те­­пенна роль эфи­­ров и амидов холина, заслужи­ваю­щих су­щественного вни­мания с точ­­­ки зрения осо­бен­ностей их син­­­теза и био­ло­ги­чес­­кой актив­нос­ти (34). Сог­лас­но результатам данных исследо­ва­ний хо­ли­но­­вы­­ми эфи­рами и амидами осу­­щест­в­ля­ет­­ся ряд важ­ней­ших функций в организме че­­ло­ве­ка и жи­вот­ных. Вместе с тем про­­­дол­жа­ют отсутствовать сведения от­но­си­тель­но при­ме­­нения эфи­ров и амидов хо­ли­на при спин­но­моз­го­вых пов­­реждениях раз­лич­­ной сте­пени вы­ра­жен­ности и ре­­зуль­­татов их дей­ствия на ­ней­ро­ны СМ и ГМ.

В связи с этим, на­ми предло­же­на экспериментальная клиническая модель, описы­ва­ю­щая сочетанное ис­поль­зо­ва­ние ФП ЛД, гормона ЩЖ – Т4 и синтезированного нами произ­вод­но­го холина йод­­метилата 2 – (ди­­ме­тил­ами­но) эти­лового эфи­ра N – (п – ме­то­кси­бен­зо­ил) – D, L – фенилаланина (ИДФ) при ЛГМС СМ крыс с регистрацией в режиме on-line фо­но­вой элек­три­ческой активности (ФА) одиночных пирамидных нейронов (ПН) КБП ГМ. Це­ле­сообразность использования Т4 и ИДФ в данной модели обусловлена их ролью как сти­му­ля­т­оров обменных про­цессов в повреждённых клетках, со стимуляцией роста аксонов, по кото­рым восстанавли­ва­­ет­ся проводимость импульсов от периферии к КБП. Накопившейся за пос­лед­ние го­ды экспериментальный и клинический материал дает основания для некото­рых обоб­щений, ка­сающихся как физиологического действия Т4 и ИДФ, так и специ­фичности их влия­ния на об­менные процессы.

Материал и методы

            Эксперименты были поставлены на 80 белых крысах – самцах (массой 200 – 240 г.), раз­­деленным на 3 группы: первая – 20 экземпляров – интактные животные; вторая – 30 эк­зем­п­ляров – животные с ЛГМС СМ, не полу­чав­шие сочетанного комплекса препара­тов; третья – 30 экземпляров –  животные с ЛГМС СМ, получавшие в течение 1 месяца сочетанные инъекции ФП ЛД, Т4 и ИДФ в место повреждения ( ЛД – из рас­чета 32 ед/кг; Т4 – 200 мкг/кг массы животного; ИДФ – 200 мкг/кг массы животного). Животные опе­ри­ро­вались в стериль­ных условиях под хлоралозо – нембуталовым наркозом. Под брюхо нар­ко­тизированного жи­вот­ного под­кла­ды­вался  небольшой валик и передние лапы подтяги­ва­лись к задним. В грудной части спи­ны вы­стригали и выбривали шерсть, затем смазывали ко­жу йодом. Операционное поле об­к­ла­ды­ва­лось стерильными салфетками, после чего произ­во­ди­ли разрез по линии остистых от­рост­ков на уровне отделов Т8 – Т9 позвоночника. Мыш­цы по сторонам отростков от­слаи­ва­лись в стороны до самых дужек позвонков. Маленькими кост­­ными щип­ца­ми резецирова­лись остис­тые отростки двух поз­вон­ков, специальными крюч­ка­­ми разд­ви­га­лись дужки поз­вон­ков. С по­мо­щью утончен­но­го ката­рак­таль­ного скальпеля про­из­водили ЛГМС СМ на вышеуказанном уров­­не. Затем приостанавлива­ли кровотечение с помощью мест­­но­го кровоостанавливающего сред­ства с последующим тща­­тельным орошением физио­ло­ги­чес­ким раствором. После этого уз­ловыми швами сшивали мышцы и кожу. Всего было прооперированно 60 крыс. За каждым животным велись индиви­ду­аль­ные кли­­нические наблюдения. Проводилась каждодневная проверка состояния животных, с соот­вет­­ствующей регистрацией в специальных протоколах наблюдений.

Проведенные исследо­ва­ния показали, что у крыс после ЛГМС СМ вы­яв­­ляется Броун – Секаровский паралич, выражающийся нарушением локомоции задних ко­неч­ностей, особенно левой. Однако местные спинальные рефлексы при этом сохранялись. Так, в ответ на пос­ту­ки­вание крестцовой кости возникали рефлекторные движения, сильнее вы­раженные со стороны левой задней конечности, чем правой. Помимо того, слева, то есть на стороне опе­ра­ции ниже уровня ЛГМС, понижалась также тактильная чувствитель­ность, но повышалась воз­будимость на болевые (укол булавкой, щипки пинцетом) раз­дра­жи­те­ли. Между тем на правой, то есть противоположной операции стороне тела, ниже уровня ЛГМС, отмечалось падение возбудимости при раздражении гальваническим или индук­цион­­ными токами. Наблю­да­лись изменения и кожной температуры задних конечностей, вы­ра­­жающиеся повышением слева при отсутствии существенных изменений справа. Наблюда­е­­мые нарушения постепенно проходили, причем вначале двигательные с контралатеральной опе­­рации стороны, затем ип­си­латеральной, потом исчезали чувствительные нарушения.

После завершения дачи препаратов на всех 3 группах животных были поставлены элек­тро­физиологические эксперименты. Микро­элек­трофизиологическими мето­да­ми с при­ме­­нением стек­­­лян­ных микро­элек­тро­дов (диаметр кончика 2 – 4 микрон, заполнен­ных 2М раст­во­ром NaCl) производилась регистрация ФА одиночных ПН КБП ГМ в I – IV слоях КБП ГМ крыс. Анализ ФА данных ПН про­из­во­ди­ли пос­ред­ст­вом ис­поль­зо­­ва­ния спе­ци­аль­ных прог­рамм на ком­пьютере (on – line). Выборка спайков про­во­ди­лась с помо­щью амп­ли­тудного дис­­­­крими­на­то­ра посред­ст­вом программного анализа.

Результаты и обсуждение

В данных сериях исследований проводилась запись внеклеточной ФА одиночных  ПН  в I – IV слоях (1 и 2 –ые сенсомоторных зоны) КБП ГМ крыс у всех 3 – х групп экспери­мен­таль­ных животных. Результаты исследований показали стойкий эффект нор­ма­ли­за­ции ФА одиночных ПН КБП ГМ у крыс 3 – ей группы, пос­ле сис­тематического введения сочетанного комплекса препаратов в определенных вы­ше­ука­занных дози­ров­ках.

На рис. 1 представлена картина внеклеточной ФА одиночного ПН в IV слое КБП ГМ у интактных крыс. На данном рисунке внеклеточная ФА данного нейрона представлена регулярным типом разряда ПН. Рис. 2 демонстрирует изменение внеклеточной ФА одиночных ПН КБП ГМ в IV слое при органическом повреждении СМ – ЛГМС. В записи ФА одиночных  ПН сенсомоторных зон коры больших полу­ша­рий го­лов­ного мозга у животных 2 – ой группы полностью отсутствует картина нормализации ФА одиночных ПН и происходит её резкое урежение с возникновением патологического «пачечного» типа разряда ПН, вызванное, ве­ро­ятно, интесивностью спинального повреждения. На рис. 3 представлен эффект норма­лиз­ации внеклеточной ФА одиночного ПН IV слоя КБП ГМ у крыс с ЛГМС, получавших комп­лекс препаратов с переходом её в регулярный тип разряда ПН. В запи­си ФА в I – IV слоях КБП ГМ крыс мы наблю­да­ли следующий фе­но­мен – у жи­вот­ных 3 – ей груп­­пы (рис. 3) картина ФА одиночных ПМ КБП во всех вышеуказанных её слоях приб­­ли­жа­ет­ся к таковой у жи­вотных 1 – ой груп­пы (рис. 1). Это свидетельствует, вероятно, о стойких про­­цес­сах вос­ста­нов­ле­ния внеклеточной ФА одиночных ПН КБП ГМ у жи­вот­ных, полу­чав­ших ежед­невные инъекции комплекса препаратов. Проведенные нами исследования, показали, что у животных с ЛГМС СМ, получавшим инъекции сочетанного комплекса препаратов в место повреждения, наблюдается наи­бо­лее стойкая картина вос­становления внеклеточной ФА ПН КБП ГМ крыс. У крыс с ЛГМС СМ (2 группа) не полу­чав­ших данного комплекса препаратов картина восстановления вы­ра­жена значительно хуже. На основании прове­денных ис­сле­до­ва­ний можно сделать вывод о целе­со­об­разности при­менения гормона ЩЖ Т4, фермента ЛД и холинового эфира ИДФ при органических пов­­реж­де­ниях СМ, что иллюстрируется поведением одиночных пирамидных ней­­ронов сенсомоторных зон КБП ГМ в I – IV слоях.

Многолетняя практика исследований подтверждает эффективность применения  раз­лич­ных сочетаний ФП при органических повреждениях СМ. Имеются дан­­ные об изучении разной ферментотерапии на функционально – структурное состояние СМ при его полной перерезке (35), а также данные о гисто – физиологической ха­­ра­ктеристике полностью перерезан­ного СМ при применении лидазы, прозе­ри­на, пирогенала, стрихнина (36). Эффекты Т4 и ИДФ на ЦНС можно рассматривать в различ­ных аспектах, что связано, с одной стороны, с многообразием структурных уровней нервной сис­темы, а с другой – с многообразием функ­ций, выполняемых ЦНС в орга­низ­ме животных.

Данная экспериментальная клиническая модель имеет свои преимущества да­же по сравнению с животными, в отдельности получавшими инъекции либо ЛД, ли­бо гор­мона ЩЖ – Т4, либо холинового эфира ИДФ. Она является, по нашему мнению, наиболее опти­мальным сочетанием, которое может применяться при органических повреждениях СМ.